【摘要】：隨著現(xiàn)今醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展以及人類(lèi)的生活健康水平的不斷提高,藥物的研發(fā)不再單單注重藥物的創(chuàng)新性,其研究重點(diǎn)也逐漸向藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)靠攏�，F(xiàn)今要判斷一個(gè)藥物是否有應(yīng)用前景特別是市場(chǎng)前景,療效和毒副作用雖然仍然是最關(guān)鍵的因素,但決不是判斷的全部因素�，F(xiàn)在的藥物研發(fā)部門(mén)越來(lái)越重視新藥物是否能具備良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì),否則即使藥物具備療效也不能成功在人體內(nèi)部發(fā)揮功效,甚至?xí)隗w內(nèi)堆積毒素。例如典型的肽類(lèi)藥物,許多生物活性肽,例如內(nèi)啡肽等均具有高效低毒的特點(diǎn),但是由于在體內(nèi)不穩(wěn)定,口服該類(lèi)藥物不能起到任何效果。因此,藥代動(dòng)力學(xué)的研究在藥品的研發(fā)階段是十分重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。藥代動(dòng)力學(xué)是主要研究藥物進(jìn)入人體的過(guò)程,基本過(guò)程包括藥物的吸收,分布,代謝和排泄。本文意在研究藥物代謝過(guò)程,特別是外源物質(zhì)的代謝。細(xì)胞色素P450(又簡(jiǎn)稱(chēng)CYP)是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族基因編碼的同工酶,由于該酶在450nm有最大紫外吸收峰,因此該類(lèi)酶被稱(chēng)為P450。細(xì)胞色素P450主要分布于肝臟,同時(shí)某些P450酶在小腸,腎臟,肺和大腦中也有少量分布表達(dá)。由于大約90%的藥物都經(jīng)由細(xì)胞色素P450代謝,因此對(duì)于藥物代謝的研究領(lǐng)域則大部分都聚集在研究細(xì)胞色素P450上。細(xì)胞色素P450可催化體內(nèi)多種反應(yīng),包括氧化還原反應(yīng),環(huán)氧化反應(yīng),N-脫羥基反應(yīng),O-脫羥基反應(yīng),S-氧化和羥基化反應(yīng)等等。細(xì)胞色素P450可代謝大約25萬(wàn)種外源性物質(zhì),包括藥物,環(huán)境中的化合物和污染物,自然界中植物產(chǎn)物,殺蟲(chóng)劑,鹵化烴,多環(huán)芳香烴、芳基胺、燃燒的成分,除草劑等等。本課題主要包括兩大部分:甾體類(lèi)興奮劑的代謝和細(xì)胞色素3A家族酶的底物和抑制劑的篩選探究。其中,對(duì)于甾體類(lèi)興奮劑,意在合成該興奮劑的在人體中的代謝物,從而作為世界反興奮劑機(jī)構(gòu)尿檢結(jié)果的參照標(biāo)準(zhǔn)品。而對(duì)于細(xì)胞色素3A家族酶,意在探究其中四種同工酶CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43的特異性底物,活性表征及抑制作用,從而為細(xì)胞色素P450研究領(lǐng)域提供更多的信息。興奮劑,原英文名稱(chēng)為“Dope”,原義是指“供賽馬時(shí)使用的一種鴉片麻醉混合劑”,多指刺激劑類(lèi)的藥物。而禁用藥物,是指運(yùn)動(dòng)員為提高比賽成績(jī)或延緩訓(xùn)練強(qiáng)度而服用的一類(lèi)藥物的總稱(chēng),所含類(lèi)別也由之前的四大類(lèi)擴(kuò)大到七大類(lèi),其中包括刺激劑、麻醉止痛劑、合成類(lèi)固醇類(lèi)、利尿劑、β-阻斷劑、內(nèi)源性肽激素及血液興奮劑。而事實(shí)上,國(guó)際上所說(shuō)的興奮劑則指全部禁用類(lèi)藥物,而不僅僅指可以起到興奮作用的刺激劑。但現(xiàn)今,興奮劑的范圍則變得更為廣泛,概念也更為嚴(yán)格,甚至一些為了提高比賽成績(jī)而使用的不正當(dāng)?shù)姆椒ɑ蛐睦硎侄?現(xiàn)今也被納入興奮劑的范疇。國(guó)際運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)會(huì)的國(guó)際興奮劑會(huì)議將興奮劑的概念定義:參加競(jìng)賽的運(yùn)動(dòng)員使用任何異體物質(zhì),或以不正常的量和不正常的進(jìn)入機(jī)體的途徑使用生理物質(zhì),試圖人為地以不正當(dāng)方式提高其競(jìng)賽成績(jī)的行為,這些物質(zhì)則都被稱(chēng)為興奮劑。2018年平昌冬奧會(huì)俄羅斯全隊(duì)由于興奮劑而被禁賽,可見(jiàn),興奮劑的濫用已經(jīng)造成了很惡劣的影響,關(guān)于反興奮劑的斗爭(zhēng)也一直進(jìn)行著。對(duì)于反興奮劑工作的進(jìn)行,對(duì)運(yùn)動(dòng)員尿液中興奮劑殘留物的檢測(cè)則始終是反興奮劑的工作重點(diǎn)之一。隨著分析檢測(cè)儀器的發(fā)展,特別是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的進(jìn)步,使得復(fù)雜生物基質(zhì)中的微量成分可以被精確測(cè)定,并極大促進(jìn)了興奮劑檢測(cè)手段的進(jìn)步。目前,興奮劑檢測(cè)的主要方法有氣相色譜、高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等等。本研究課題的第一部分是關(guān)于興奮劑代謝的研究。在眾多類(lèi)型的興奮劑中,合成代謝雄激素類(lèi)固醇(AAS)在體育競(jìng)賽中被以刺激劑而被頻繁地濫用。本課題對(duì)合成代謝雄激素類(lèi)固醇之一的興奮劑代謝進(jìn)行研究,意在體外合成4-脫氫氯甲基睪酮(DHCMT,化學(xué)名稱(chēng):4-氯-17β-羥基-17α-甲基雄甾-1,4-二烯-3-酮,商標(biāo)名稱(chēng):特力補(bǔ))的長(zhǎng)期代謝物。關(guān)于該種興奮劑的研究表明,其存在多種類(lèi)型的代謝物,其中一種為長(zhǎng)期代謝物20βOH-NorDHCMT(4-氯-17β-羥甲基-17α-甲基-18-去甲雄甾-1,4,13-三烯-3-酮),顧名思義該類(lèi)代謝物存在于尿液中可被檢測(cè)的時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)給藥22天后,換言之,即使是在長(zhǎng)時(shí)間服用該興奮劑后,依然可在尿液中檢測(cè)到其殘留的代謝物,從而判定運(yùn)動(dòng)員是否有服用禁用藥物。然而,到目前為止,并沒(méi)有已純化的長(zhǎng)期代謝物作為參照標(biāo)準(zhǔn)品,因此本課題的目的則在于合成純化出20βOH-NorDHCMT。其中,本文通過(guò)Wagner-Meerwein重排反應(yīng)處理DHCMT,隨后利用表達(dá)可表達(dá)人CYP21A2的重組裂殖酵母菌株進(jìn)行全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化,并通過(guò)發(fā)酵技術(shù)和制備液相色譜技術(shù)合成純化出毫克量的該代謝物,以液質(zhì)聯(lián)用及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為檢測(cè)手段,對(duì)純化出的代謝物進(jìn)行表征,最終將表征結(jié)果與給藥后的尿液樣本進(jìn)行分析對(duì)照。結(jié)果顯示體外通過(guò)化學(xué)生物法合成的長(zhǎng)期代謝物與給藥后的尿液檢測(cè)到的殘留物為同種物質(zhì),因此可用作反興奮劑機(jī)構(gòu)的參照標(biāo)準(zhǔn)品,且該方法可作為生產(chǎn)20βOH-NorDHCMT標(biāo)準(zhǔn)品的方法之一。該課題所提供的參照標(biāo)準(zhǔn)品將為今后賽場(chǎng)上DHCMT的濫用提供無(wú)可置疑的證據(jù)。涉及藥物代謝的細(xì)胞色素P450主要為CYP1、CYP2、CYP3家族中7種重要的亞型:CYP1A2(占P450代謝藥物的4%)、CYP2A6(2%)、CYP2C9(10%)、CYP2C19(2%)、CYP2D6(30%)、CYP2E1(2%)、CYP3A4(50%)。其中,CYP3A家族是分布最廣泛,研究最多的一類(lèi)細(xì)胞色素。CYP3A家族同工酶大部分分布在人體肝臟和小腸內(nèi),包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43,四種酶總量平均可以占到人體肝臟內(nèi)全部CYP系統(tǒng)的大約30%左右。而現(xiàn)今市上所售的大多數(shù)氧化型的藥物都至少可以被部分CYP3A家族的酶代謝。在CYP3A家族中,CYP3A4是主要的成人型亞型,主要在人的肝臟和小腸表達(dá)。CYP3A5在大約20%的人群中呈多態(tài)性表達(dá),而CYP3A7只在胎兒肝臟表達(dá),當(dāng)然在某些成人體內(nèi)也可以找到CYP3A7的存在。而對(duì)于CYP3A43,這是近些年才剛剛發(fā)現(xiàn)的一種酶,因此對(duì)于它的性質(zhì)以及它在人體藥物代謝方面的意義的研究非常有限,即使有也是鮮有報(bào)道。因此在本課題中,CYP3A43也是CYP3A家族部分的研究重點(diǎn)。現(xiàn)今關(guān)于CYP3A43,大部分的研究都是關(guān)于CYP3A43與前列腺癌發(fā)病原因的關(guān)系探究,而對(duì)于CYP3A43酶活性的研究,特別是對(duì)其特異性底物和抑制劑的探究則一直是這個(gè)領(lǐng)域的缺口。因此在本課題中,則重點(diǎn)為CYP3A43篩選了特異性底物和抑制劑,并且嘗試探究如何提高其代謝活性。由于許多藥物和外源性的化學(xué)物質(zhì)都是CYP3A重要的底物,因此酶在藥物的相互作用的影響不得不考慮。在藥物代謝的相互作用中,酶抑制引起的藥物相互作用占全部相互作用的70%,酶誘導(dǎo)引起的相互作用約占23%,其他則占7%。而在眾多的藥物不良反應(yīng)中,細(xì)胞色素P450酶抑制作用則是引起藥物不良反應(yīng)的最常見(jiàn)原因。因?yàn)楫?dāng)一種藥物可以抑制人體的某一種細(xì)胞色素P450時(shí),可被該種P450酶代謝的另一種藥物的清除率便會(huì)相應(yīng)降低,其半衰期則會(huì)隨之延長(zhǎng),導(dǎo)致該種藥物血藥濃度增加,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致內(nèi)臟毒性。換言之,藥物對(duì)酶的抑制作用會(huì)影響到酶對(duì)其他藥物的代謝清除作用,從而導(dǎo)致毒性產(chǎn)生。這就是研究酶抑制作用的必要性。事實(shí)上,在人體內(nèi)CYP3A家族中各種酶的表達(dá)和活性都有很明顯的個(gè)體差異,像年齡、性別、種族等都會(huì)成為產(chǎn)生差異的因素。因此對(duì)于CYP3A家族的研究始終具有很大的現(xiàn)實(shí)意義,也具備很大的研究潛力。本課題的第二部分則是關(guān)于細(xì)胞色素P450酶中CYP3A家族中所包含的四種同工酶(CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43)的活性與抑制作用的探究。該部分意在為57種細(xì)胞色素的代謝活性及抑制作用的集合提供數(shù)據(jù)。由于細(xì)胞色素P450可以代謝市面上90%的藥物,企業(yè)在藥物研發(fā)環(huán)節(jié)中不可避免的會(huì)涉及到對(duì)P450活性及抑制作用信息的集合。例如在檢測(cè)新藥品是否會(huì)由于P450的代謝而產(chǎn)生毒性時(shí),又或者是在眾多P450中篩選某種酶的特異性抑制劑時(shí),因此對(duì)全部57種細(xì)胞色素P450的活性與抑制作用信息的總結(jié)是十分必要的,從而可以隨機(jī)混合幾種P450,利用“雞尾酒法”可以快速篩選酶特異性底物或抑制劑,但現(xiàn)今并未見(jiàn)有關(guān)于此的報(bào)道。本課題組擁有可以表達(dá)這57種人P450的重組裂殖酵母菌株;且具備成熟的可以快速篩選底物和抑制劑的方法,即滲透重組裂殖酵母法,亦稱(chēng)酶包法;更具有大量多種類(lèi)的發(fā)光底物及常用抑制劑,因此可以完成全部57種細(xì)胞色素P450的活性與抑制作用信息的總結(jié)。本文則主要研究細(xì)胞色素P450酶中CYP3A家族的四種酶對(duì)兩種發(fā)光底物(Luciferin H和Luciferin ME)活性測(cè)定及三種常見(jiàn)抑制劑(酮康唑、來(lái)曲唑、芐基咪唑)的抑制度測(cè)定,但由于CYP3A43是CYP3A家族中研究最少的一種酶,關(guān)于其特異性底物和抑制劑的相關(guān)研究都很少,因此對(duì)CYP3A43進(jìn)行了六種發(fā)光底物(Luciferin H、Luciferin ME、Luciferin IPA、Luciferin PFBE、Luciferin BE和Luciferin PPXE)的篩選。研究發(fā)現(xiàn),CYP3A5與CYP3A7均可以代謝Luciferin H和Luciferin ME,CYP3A4可代謝Luciferin H。且CYP3A7對(duì)Luciferin H代謝活性最高,CYP3A5對(duì)Luciferin ME的代謝活性更高;CYP3A43可以代謝Luciferin PPXE。但由于CYP3A43對(duì)Luciferin PPXE的代謝活性較低,本課題構(gòu)建可以表達(dá)細(xì)胞色素B5(CytB_5)及細(xì)胞色素B5還原酶(CytB_5R)的重組菌株,CYP3A43對(duì)Luciferin PPXE的代謝活性可被提高約46%。綜上所述,本文針對(duì)細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝進(jìn)行了一定程度上的研究,課題主要分為兩大部分,圍繞細(xì)胞色素P450對(duì)興奮劑的代謝以及對(duì)發(fā)光底物的代謝進(jìn)行探究,豐富了細(xì)胞色素P450領(lǐng)域的研究?jī)?nèi)容。對(duì)于細(xì)胞色素P450代謝興奮劑部分,本課題最終在體外用化學(xué)生物結(jié)合法成功合成4-脫氫氯甲基睪酮(DHCMT)的長(zhǎng)期代謝物20βOH-NorDHCMT,并作為檢測(cè)4-脫氫氯甲基睪酮的參照標(biāo)準(zhǔn)品,為運(yùn)動(dòng)員在比賽場(chǎng)上對(duì)該種興奮劑的濫用提供了堅(jiān)實(shí)的證據(jù),從而為世界反興奮劑的斗爭(zhēng)貢獻(xiàn)出了自己的一份力量。關(guān)于CYP3A家族同工酶活性和抑制作用的探究,研究發(fā)現(xiàn)CYP3A5與CYP3A7均增加了兩種可被代謝的發(fā)光底物L(fēng)uciferin H和Luciferin ME,CYP3A43增加了一種可被代謝的發(fā)光底物L(fēng)uciferin PPXE,并且發(fā)現(xiàn)可同時(shí)表達(dá)人細(xì)胞色素P450氧化還原酶(CPR)、人細(xì)胞色素B5(CytB_5)及細(xì)胞色素B5還原酶(CytB_5R)三種還原酶的重組裂殖酵母菌株可以增強(qiáng)細(xì)胞色素P450對(duì)特異性發(fā)光底物的代謝強(qiáng)度。該項(xiàng)研究為細(xì)胞色素P450領(lǐng)域關(guān)于活性以及抑制作用的研究范圍豐富了數(shù)據(jù),特別是發(fā)現(xiàn)了CYP3A43的一種新發(fā)光底物,為今后CYP3A43的研究提供了新素材,同時(shí)為藥物研發(fā)企業(yè)運(yùn)行“雞尾酒法”打下了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2671014