【摘要】：隨著現(xiàn)今醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展以及人類的生活健康水平的不斷提高,藥物的研發(fā)不再單單注重藥物的創(chuàng)新性,其研究重點也逐漸向藥物的藥代動力學(xué)性質(zhì)靠攏�，F(xiàn)今要判斷一個藥物是否有應(yīng)用前景特別是市場前景,療效和毒副作用雖然仍然是最關(guān)鍵的因素,但決不是判斷的全部因素�，F(xiàn)在的藥物研發(fā)部門越來越重視新藥物是否能具備良好的藥代動力學(xué)性質(zhì),否則即使藥物具備療效也不能成功在人體內(nèi)部發(fā)揮功效,甚至?xí)隗w內(nèi)堆積毒素。例如典型的肽類藥物,許多生物活性肽,例如內(nèi)啡肽等均具有高效低毒的特點,但是由于在體內(nèi)不穩(wěn)定,口服該類藥物不能起到任何效果。因此,藥代動力學(xué)的研究在藥品的研發(fā)階段是十分重要的一個環(huán)節(jié)。藥代動力學(xué)是主要研究藥物進入人體的過程,基本過程包括藥物的吸收,分布,代謝和排泄。本文意在研究藥物代謝過程,特別是外源物質(zhì)的代謝。細胞色素P450(又簡稱CYP)是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族基因編碼的同工酶,由于該酶在450nm有最大紫外吸收峰,因此該類酶被稱為P450。細胞色素P450主要分布于肝臟,同時某些P450酶在小腸,腎臟,肺和大腦中也有少量分布表達。由于大約90%的藥物都經(jīng)由細胞色素P450代謝,因此對于藥物代謝的研究領(lǐng)域則大部分都聚集在研究細胞色素P450上。細胞色素P450可催化體內(nèi)多種反應(yīng),包括氧化還原反應(yīng),環(huán)氧化反應(yīng),N-脫羥基反應(yīng),O-脫羥基反應(yīng),S-氧化和羥基化反應(yīng)等等。細胞色素P450可代謝大約25萬種外源性物質(zhì),包括藥物,環(huán)境中的化合物和污染物,自然界中植物產(chǎn)物,殺蟲劑,鹵化烴,多環(huán)芳香烴、芳基胺、燃燒的成分,除草劑等等。本課題主要包括兩大部分:甾體類興奮劑的代謝和細胞色素3A家族酶的底物和抑制劑的篩選探究。其中,對于甾體類興奮劑,意在合成該興奮劑的在人體中的代謝物,從而作為世界反興奮劑機構(gòu)尿檢結(jié)果的參照標(biāo)準(zhǔn)品。而對于細胞色素3A家族酶,意在探究其中四種同工酶CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43的特異性底物,活性表征及抑制作用,從而為細胞色素P450研究領(lǐng)域提供更多的信息。興奮劑,原英文名稱為“Dope”,原義是指“供賽馬時使用的一種鴉片麻醉混合劑”,多指刺激劑類的藥物。而禁用藥物,是指運動員為提高比賽成績或延緩訓(xùn)練強度而服用的一類藥物的總稱,所含類別也由之前的四大類擴大到七大類,其中包括刺激劑、麻醉止痛劑、合成類固醇類、利尿劑、β-阻斷劑、內(nèi)源性肽激素及血液興奮劑。而事實上,國際上所說的興奮劑則指全部禁用類藥物,而不僅僅指可以起到興奮作用的刺激劑。但現(xiàn)今,興奮劑的范圍則變得更為廣泛,概念也更為嚴(yán)格,甚至一些為了提高比賽成績而使用的不正當(dāng)?shù)姆椒ɑ蛐睦硎侄?現(xiàn)今也被納入興奮劑的范疇。國際運動醫(yī)學(xué)會的國際興奮劑會議將興奮劑的概念定義:參加競賽的運動員使用任何異體物質(zhì),或以不正常的量和不正常的進入機體的途徑使用生理物質(zhì),試圖人為地以不正當(dāng)方式提高其競賽成績的行為,這些物質(zhì)則都被稱為興奮劑。2018年平昌冬奧會俄羅斯全隊由于興奮劑而被禁賽,可見,興奮劑的濫用已經(jīng)造成了很惡劣的影響,關(guān)于反興奮劑的斗爭也一直進行著。對于反興奮劑工作的進行,對運動員尿液中興奮劑殘留物的檢測則始終是反興奮劑的工作重點之一。隨著分析檢測儀器的發(fā)展,特別是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的進步,使得復(fù)雜生物基質(zhì)中的微量成分可以被精確測定,并極大促進了興奮劑檢測手段的進步。目前,興奮劑檢測的主要方法有氣相色譜、高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等等。本研究課題的第一部分是關(guān)于興奮劑代謝的研究。在眾多類型的興奮劑中,合成代謝雄激素類固醇(AAS)在體育競賽中被以刺激劑而被頻繁地濫用。本課題對合成代謝雄激素類固醇之一的興奮劑代謝進行研究,意在體外合成4-脫氫氯甲基睪酮(DHCMT,化學(xué)名稱:4-氯-17β-羥基-17α-甲基雄甾-1,4-二烯-3-酮,商標(biāo)名稱:特力補)的長期代謝物。關(guān)于該種興奮劑的研究表明,其存在多種類型的代謝物,其中一種為長期代謝物20βOH-NorDHCMT(4-氯-17β-羥甲基-17α-甲基-18-去甲雄甾-1,4,13-三烯-3-酮),顧名思義該類代謝物存在于尿液中可被檢測的時間可長達給藥22天后,換言之,即使是在長時間服用該興奮劑后,依然可在尿液中檢測到其殘留的代謝物,從而判定運動員是否有服用禁用藥物。然而,到目前為止,并沒有已純化的長期代謝物作為參照標(biāo)準(zhǔn)品,因此本課題的目的則在于合成純化出20βOH-NorDHCMT。其中,本文通過Wagner-Meerwein重排反應(yīng)處理DHCMT,隨后利用表達可表達人CYP21A2的重組裂殖酵母菌株進行全細胞生物轉(zhuǎn)化,并通過發(fā)酵技術(shù)和制備液相色譜技術(shù)合成純化出毫克量的該代謝物,以液質(zhì)聯(lián)用及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為檢測手段,對純化出的代謝物進行表征,最終將表征結(jié)果與給藥后的尿液樣本進行分析對照。結(jié)果顯示體外通過化學(xué)生物法合成的長期代謝物與給藥后的尿液檢測到的殘留物為同種物質(zhì),因此可用作反興奮劑機構(gòu)的參照標(biāo)準(zhǔn)品,且該方法可作為生產(chǎn)20βOH-NorDHCMT標(biāo)準(zhǔn)品的方法之一。該課題所提供的參照標(biāo)準(zhǔn)品將為今后賽場上DHCMT的濫用提供無可置疑的證據(jù)。涉及藥物代謝的細胞色素P450主要為CYP1、CYP2、CYP3家族中7種重要的亞型:CYP1A2(占P450代謝藥物的4%)、CYP2A6(2%)、CYP2C9(10%)、CYP2C19(2%)、CYP2D6(30%)、CYP2E1(2%)、CYP3A4(50%)。其中,CYP3A家族是分布最廣泛,研究最多的一類細胞色素。CYP3A家族同工酶大部分分布在人體肝臟和小腸內(nèi),包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43,四種酶總量平均可以占到人體肝臟內(nèi)全部CYP系統(tǒng)的大約30%左右。而現(xiàn)今市上所售的大多數(shù)氧化型的藥物都至少可以被部分CYP3A家族的酶代謝。在CYP3A家族中,CYP3A4是主要的成人型亞型,主要在人的肝臟和小腸表達。CYP3A5在大約20%的人群中呈多態(tài)性表達,而CYP3A7只在胎兒肝臟表達,當(dāng)然在某些成人體內(nèi)也可以找到CYP3A7的存在。而對于CYP3A43,這是近些年才剛剛發(fā)現(xiàn)的一種酶,因此對于它的性質(zhì)以及它在人體藥物代謝方面的意義的研究非常有限,即使有也是鮮有報道。因此在本課題中,CYP3A43也是CYP3A家族部分的研究重點。現(xiàn)今關(guān)于CYP3A43,大部分的研究都是關(guān)于CYP3A43與前列腺癌發(fā)病原因的關(guān)系探究,而對于CYP3A43酶活性的研究,特別是對其特異性底物和抑制劑的探究則一直是這個領(lǐng)域的缺口。因此在本課題中,則重點為CYP3A43篩選了特異性底物和抑制劑,并且嘗試探究如何提高其代謝活性。由于許多藥物和外源性的化學(xué)物質(zhì)都是CYP3A重要的底物,因此酶在藥物的相互作用的影響不得不考慮。在藥物代謝的相互作用中,酶抑制引起的藥物相互作用占全部相互作用的70%,酶誘導(dǎo)引起的相互作用約占23%,其他則占7%。而在眾多的藥物不良反應(yīng)中,細胞色素P450酶抑制作用則是引起藥物不良反應(yīng)的最常見原因。因為當(dāng)一種藥物可以抑制人體的某一種細胞色素P450時,可被該種P450酶代謝的另一種藥物的清除率便會相應(yīng)降低,其半衰期則會隨之延長,導(dǎo)致該種藥物血藥濃度增加,嚴(yán)重時可導(dǎo)致內(nèi)臟毒性。換言之,藥物對酶的抑制作用會影響到酶對其他藥物的代謝清除作用,從而導(dǎo)致毒性產(chǎn)生。這就是研究酶抑制作用的必要性。事實上,在人體內(nèi)CYP3A家族中各種酶的表達和活性都有很明顯的個體差異,像年齡、性別、種族等都會成為產(chǎn)生差異的因素。因此對于CYP3A家族的研究始終具有很大的現(xiàn)實意義,也具備很大的研究潛力。本課題的第二部分則是關(guān)于細胞色素P450酶中CYP3A家族中所包含的四種同工酶(CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43)的活性與抑制作用的探究。該部分意在為57種細胞色素的代謝活性及抑制作用的集合提供數(shù)據(jù)。由于細胞色素P450可以代謝市面上90%的藥物,企業(yè)在藥物研發(fā)環(huán)節(jié)中不可避免的會涉及到對P450活性及抑制作用信息的集合。例如在檢測新藥品是否會由于P450的代謝而產(chǎn)生毒性時,又或者是在眾多P450中篩選某種酶的特異性抑制劑時,因此對全部57種細胞色素P450的活性與抑制作用信息的總結(jié)是十分必要的,從而可以隨機混合幾種P450,利用“雞尾酒法”可以快速篩選酶特異性底物或抑制劑,但現(xiàn)今并未見有關(guān)于此的報道。本課題組擁有可以表達這57種人P450的重組裂殖酵母菌株;且具備成熟的可以快速篩選底物和抑制劑的方法,即滲透重組裂殖酵母法,亦稱酶包法;更具有大量多種類的發(fā)光底物及常用抑制劑,因此可以完成全部57種細胞色素P450的活性與抑制作用信息的總結(jié)。本文則主要研究細胞色素P450酶中CYP3A家族的四種酶對兩種發(fā)光底物(Luciferin H和Luciferin ME)活性測定及三種常見抑制劑(酮康唑、來曲唑、芐基咪唑)的抑制度測定,但由于CYP3A43是CYP3A家族中研究最少的一種酶,關(guān)于其特異性底物和抑制劑的相關(guān)研究都很少,因此對CYP3A43進行了六種發(fā)光底物(Luciferin H、Luciferin ME、Luciferin IPA、Luciferin PFBE、Luciferin BE和Luciferin PPXE)的篩選。研究發(fā)現(xiàn),CYP3A5與CYP3A7均可以代謝Luciferin H和Luciferin ME,CYP3A4可代謝Luciferin H。且CYP3A7對Luciferin H代謝活性最高,CYP3A5對Luciferin ME的代謝活性更高;CYP3A43可以代謝Luciferin PPXE。但由于CYP3A43對Luciferin PPXE的代謝活性較低,本課題構(gòu)建可以表達細胞色素B5(CytB_5)及細胞色素B5還原酶(CytB_5R)的重組菌株,CYP3A43對Luciferin PPXE的代謝活性可被提高約46%。綜上所述,本文針對細胞色素P450對外源物質(zhì)的代謝進行了一定程度上的研究,課題主要分為兩大部分,圍繞細胞色素P450對興奮劑的代謝以及對發(fā)光底物的代謝進行探究,豐富了細胞色素P450領(lǐng)域的研究內(nèi)容。對于細胞色素P450代謝興奮劑部分,本課題最終在體外用化學(xué)生物結(jié)合法成功合成4-脫氫氯甲基睪酮(DHCMT)的長期代謝物20βOH-NorDHCMT,并作為檢測4-脫氫氯甲基睪酮的參照標(biāo)準(zhǔn)品,為運動員在比賽場上對該種興奮劑的濫用提供了堅實的證據(jù),從而為世界反興奮劑的斗爭貢獻出了自己的一份力量。關(guān)于CYP3A家族同工酶活性和抑制作用的探究,研究發(fā)現(xiàn)CYP3A5與CYP3A7均增加了兩種可被代謝的發(fā)光底物L(fēng)uciferin H和Luciferin ME,CYP3A43增加了一種可被代謝的發(fā)光底物L(fēng)uciferin PPXE,并且發(fā)現(xiàn)可同時表達人細胞色素P450氧化還原酶(CPR)、人細胞色素B5(CytB_5)及細胞色素B5還原酶(CytB_5R)三種還原酶的重組裂殖酵母菌株可以增強細胞色素P450對特異性發(fā)光底物的代謝強度。該項研究為細胞色素P450領(lǐng)域關(guān)于活性以及抑制作用的研究范圍豐富了數(shù)據(jù),特別是發(fā)現(xiàn)了CYP3A43的一種新發(fā)光底物,為今后CYP3A43的研究提供了新素材,同時為藥物研發(fā)企業(yè)運行“雞尾酒法”打下了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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本文編號：2671014