【摘要】：淋巴瘤是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病,對(duì)于難治性或復(fù)發(fā)性患者,高劑量化療后自體干細(xì)胞移植是臨床標(biāo)準(zhǔn)治療方法�；熕幬镆劳胁窜�(簡(jiǎn)稱(chēng)VP16或EPEG)被推薦為淋巴瘤高劑量化療一線治療藥物。其作用機(jī)理為干擾DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ,間接誘導(dǎo)DNA斷裂,從而阻滯腫瘤細(xì)胞于晚S期和G2期。目前VP16的上市制劑有軟膠囊和注射液,其中軟膠囊劑口服每天50 mg,一天一次;VP16注射液規(guī)格為100mg(5mlL);500mg(25mL);1g(50 mL)三種。VP16上市制劑在臨床應(yīng)用中由于藥物溶解性差、較嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)和劑量限制性毒副作用等問(wèn)題導(dǎo)致淋巴瘤治療高劑量給藥難以實(shí)現(xiàn)。因此,急需開(kāi)發(fā)VP16新劑型解決上述問(wèn)題。近年來(lái),納米藥物的快速發(fā)展對(duì)腫瘤的治療表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。脂質(zhì)納米混懸劑(LNS)作為納米給藥系統(tǒng)中極具發(fā)展前景的一種劑型,具有以下獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):①選用脂類(lèi)材料作為穩(wěn)定劑,毒性低,生物相容性和安全性較好;②脂質(zhì)納米混懸劑的載藥量較高,無(wú)藥物泄露問(wèn)題,從而可減小給藥體積,尤其適用于VP16這種臨床應(yīng)用劑量大的難溶性藥物;③處方中只含有適量的穩(wěn)定劑,避免了大量刺激性輔料的應(yīng)用,可大大降低毒副作用,提高病人順應(yīng)性;④可利用納米制劑的增強(qiáng)滲透與滯留效應(yīng)(EPR effect)增加藥物在腫瘤部位的蓄積,在增強(qiáng)抗腫瘤作用的同時(shí)降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用;⑤脂質(zhì)納米混懸劑的處方及工藝簡(jiǎn)單可行,更適合工業(yè)化大生產(chǎn)。本研究首次以大豆卵磷脂和聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS)為穩(wěn)定劑制備依托泊苷脂質(zhì)納米混懸劑(VP16-LNS)作為靜脈注射用納米制劑,以期解決VP16上市制劑中藥物溶解性差、臨床給藥劑量大導(dǎo)致注射體積大以及刺激性輔料的應(yīng)用使患者順應(yīng)性差等問(wèn)題,在增強(qiáng)淋巴瘤治療效果的同時(shí)降低毒副作用。本課題的主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:1.VP16含量測(cè)定方法的建立本課題采用HPLC法建立了 VP16體外含量測(cè)定方法,對(duì)方法的專(zhuān)屬性、檢測(cè)限與定量限、線性、日內(nèi)日間精密度、方法回收率和加樣回收率進(jìn)行了考察。結(jié)果表明此方法專(zhuān)屬性強(qiáng),VP16濃度在25～500 μg/mL范圍內(nèi)峰面積A與濃度C線性關(guān)系良好,精密度和回收率也均符合含量測(cè)定方法學(xué)的要求。因此,可以采用HPLC法測(cè)定VP16的含量。2.VP16-LNS的處方優(yōu)化及體外性質(zhì)評(píng)價(jià)本課題采用納米沉淀法制備VP16-LNS,通過(guò)單因素考察和正交設(shè)計(jì)篩選最優(yōu)處方與工藝條件,以最優(yōu)處方工藝制備三批VP16-LNS并進(jìn)行理化性質(zhì)評(píng)價(jià),主要包括制劑外觀、微觀形態(tài)、粒徑大小、zeta電位和載藥量等。通過(guò)在VP16-LNS中加入6%(w/v)的甘露醇作為凍干保護(hù)劑制備VP16-LNS凍干制劑,以進(jìn)一步提高制劑的穩(wěn)定性便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。差示掃描量熱法和X射線衍射法考察凍干制劑的晶型結(jié)構(gòu)。采用動(dòng)態(tài)膜透析法考察VP16-LNS在pH 7.4 PBS(含1%吐溫-80,w/v)中的釋放行為。通過(guò)測(cè)定VP16-LNS在不同介質(zhì)中的粒徑變化考察其穩(wěn)定性。采用體外溶血實(shí)驗(yàn)考察VP16-LNS的初步安全性以評(píng)價(jià)其是否適用于靜脈注射給藥。最后,以Raji人源淋巴瘤細(xì)胞及A20鼠源淋巴瘤細(xì)胞為細(xì)胞模型,采用MTT法考察VP16-LNS的體外細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最優(yōu)處方制備的VP16-LNS成球形或類(lèi)球形顆粒,粒徑分布均勻,平均粒徑為(87.50士 7.44)nm,PDI 為 0.224±0.039,zeta 電位為(-7.38±0.26)mV,載藥量為(6.81 ±0.30)%。VP16-LNS凍干制劑呈均勻細(xì)膩疏松多孔的白色粉末且再分散性良好,差示掃描量熱法和X射線衍射法證明VP16-LNS的凍干制劑以無(wú)定型或非晶型狀態(tài)存在。體外釋放結(jié)果表明VP16-LNS在前5h內(nèi)VP16累積釋放量高達(dá)80%以上,隨后緩慢釋放。體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明VP16-LNS在pH 7.4 PBS,細(xì)胞培養(yǎng)基PRMI 1640及血漿中的穩(wěn)定性良好。體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VP16-LNS未發(fā)生溶血現(xiàn)象,適宜靜脈注射給藥。MTT結(jié)果表明VP16-injection和VP16-LNS對(duì)兩種淋巴瘤細(xì)胞具有明顯的濃度依賴(lài)性細(xì)胞毒性。此外,VP16-LNS在Raji和A20兩種淋巴瘤細(xì)胞上的IC50值分別為 0.508 μg/mL 和 0.219 μg/mL,VP16-injection 的 IC50 值分別為 0.735 和0.531,VP16-LNS在Raji和A20兩種淋巴瘤細(xì)胞上的IC5C值顯著低于VP 16-injection(p0.05)。3.VP16-LNS的體內(nèi)性質(zhì)評(píng)價(jià)以雌性昆明小鼠為動(dòng)物模型,采用HPLC法考察VP 16-LNS和VP16-injection尾靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性,并用DAS 2.0軟件處理藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。采用近紅外活體熒光成像技術(shù),選用親脂性近紅外熒光染料DiR碘化物代替VP 16制備DiR-LNS,觀察小鼠尾靜脈注射DiR-LNS后體內(nèi)藥物分布情況。以荷A20鼠源淋巴瘤的雌性BALB/c小鼠為動(dòng)物模型,評(píng)價(jià)VP16-LNS的體內(nèi)抗腫瘤活性。此外,本課題通過(guò)對(duì)不同處理組小鼠的體重變化、臟器系數(shù)、外周血象、肝腎指標(biāo)、各器官組織病理切片、新西蘭兔耳緣靜脈刺激性等進(jìn)行考察,評(píng)價(jià)VP16-LNS的體內(nèi)安全性。藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明,與VP16-injection相比,VP16-LNS可顯著提高小鼠體內(nèi)血漿中藥物濃度,VP16-LNS給藥組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2β、AUC0-t、AUMC0-t,和MRTo-t相比VP16-injection組分別提高到其6.37倍、1.87倍、6.14倍和3.00倍,CL 減小到 VP 16-injection 的 48%,結(jié)果表明與 VP16-injection 相比,VP 16-LNS可減慢VP16的體內(nèi)清除速度并顯著延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間,有利于增強(qiáng)抗腫瘤作用。體內(nèi)近紅外熒光成像結(jié)果表明,DiR-LNS組小鼠相比游離DiR組腫瘤部位顯示出更強(qiáng)的熒光信號(hào),是游離DiR的5.21倍,提示LNS可顯著提高藥物在腫瘤部位蓄積。體內(nèi)藥效學(xué)研究結(jié)果表明,VP16-LNS組小鼠腫瘤體積顯著小于VP16-injection組(p0.05),并且VP16-LNS組的平均瘤重顯著低于其他治療組,VP16-LNS(25mg/kg)組的腫瘤抑制率高達(dá)93.68%(p0.01),不同治療組腫瘤組織HE、Ki-67和TUNEL染色結(jié)果也證明VP16-LNS可顯著增強(qiáng)淋巴瘤的治療效果(P0.05)。小鼠體重變化、臟器系數(shù)、外周血象、肝腎指標(biāo)、各器官組織病理觀察、新西蘭兔耳緣靜脈刺激性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VP16-LNS相比VP16-injection具有更高的安全性。綜上所述,本研究制備的VP16-LNS形態(tài)圓整、粒徑小且分布較均勻,載藥量高。并且制備工藝簡(jiǎn)單可行,重現(xiàn)性好,能夠改善VP16的溶解性,延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間,增強(qiáng)抗腫瘤效果并具有較低的毒副作用,表明VP16-LNS是一種具有潛力的淋巴瘤治療劑型,具有廣闊臨床應(yīng)用前景。
【圖文】：

１．１確定檢測(cè)波長(zhǎng)逡逑用紫外－可見(jiàn)分光光度法將ＶＰ１６標(biāo)準(zhǔn)溶液在２００￣４００邋ｎｍ波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫逡逑夕卜可見(jiàn)光譜掃描，結(jié)果如圖１－１所示：逡逑１邋咖邐逡逑１！：逡逑０邋８００邐＼逡逑＼逡逑＼逡逑０邋６００邐＼逡逑０邋？０丨逡逑０邋２００邋／邐２８４邋００逡逑／邋！邐＾邐逡逑0000｜邐、逡逑２００邋００邐Ｘ邋００邐３００邋０Ｃ邐３５０邋００邐ＷＯＯＤ逡逑波長(zhǎng)１？１逡逑圖１－１邋ＶＰ１６紫外掃描圖譜（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)記錄Ｎｏ：０００４０５４－ｐ３）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ＵＶ邋ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＶＰ邋１６逡逑由ＶＰ１６紫外吸收?qǐng)D譜可以看出，其在波長(zhǎng)２１０邋ｎｍ和２８４邋ｎｍ有吸收峰，在逡逑２］０邋ｎｍ出現(xiàn)的吸收峰為末端吸收，由于末端吸收容易造成背景基線高，使得信逡逑噪比下降，從而降低檢測(cè)的靈敏度，所以不能選擇２１０邋ｎｍ作為檢測(cè)波長(zhǎng)。查閱逡逑２０１５年版《中國(guó)藥典（二部）》第６６３頁(yè)ＶＰ１６含量測(cè)定方法，其檢測(cè)波長(zhǎng)為２５４逡逑ｎｍ。結(jié)合上述紫外掃描圖譜可知，２８４邋ｎｍ處的紫外吸收比２５４邋ｎｍ處相對(duì)弱一逡逑些，所以最終檢測(cè)波長(zhǎng)確定為２５４邋ｎｍ。逡逑１．２專(zhuān)屬性考察逡逑ＶＰ１６標(biāo)準(zhǔn)溶液、輔料溶液分別進(jìn)高效液相色譜儀并記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖逡逑１－２，，邋ＶＰ１６在１３．７８６邋ｍｉｎ出現(xiàn)了吸收峰，而輔料溶液在此時(shí)間并未出現(xiàn)任何吸收逡逑峰

采用ＨＰＬＣ法測(cè)定一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，記錄結(jié)果如表１－１所示。以峰面逡逑積（Ａ）為縱坐標(biāo)，濃度（Ｃ）為橫坐標(biāo)，將峰面積Ａ對(duì)其濃度Ｃ進(jìn)行線性回歸逡逑并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖１－３。回歸方程為：Ａ＝１０．８８６Ｃ－１９．４２１邋（Ｒ２邋＝邋０．９９９８）。逡逑結(jié)果表明，ＶＰ１６在２５？５００邋ｎｇ／ｍＬ濃度范圍內(nèi)，峰面積Ａ與濃度Ｃ線性關(guān)系良逡逑好。逡逑表１－１不同濃度的ＶＰ１６溶液峰面積測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)記錄Ｎｏ：０００４０５２－ｐ３）逡逑Ｔａｂ．邋１－１邋Ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｅａｋ邋ａｒｅａ邋ｏｆ邋ＶＰ邋１６邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ逡逑Ｃ邋（＾ｉｇ／ｍＬ）邋２５邐５０邐１００邐２００邐３００邐５００逡逑峰面積（Ａ）邐２６４．６邐５３２．４邐１０２２．７邐２１６５．１邐３２８３．４邐５４０６．５２逡逑２６逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R943

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 陳充抒;梁艷;梁莉;陳虹;;納米混懸劑的制備、表征及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];武警醫(yī)學(xué);2013年04期

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本文編號(hào)：2670911