【摘要】：蛋白和多肽類藥物是藥用生物活性大分子,與體內(nèi)正常生理物質(zhì)十分接近,因此其進(jìn)行口服用藥具有獨(dú)特的生物活性和較少的副作用;尤其對(duì)于一些慢性疾病的治療,但是其口服給藥遞送系統(tǒng)生物利用度低的問題亟待解決。因此,能夠提高多肽類藥物口服生物利用度的主動(dòng)靶向納米遞藥載體的研究引起了科研人員的廣泛興趣,成為現(xiàn)代藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)。艾塞那肽是一種II型糖尿病治療藥物,可以幫助患者同時(shí)控制血糖和體重。艾塞那肽與人胰高血糖素樣肽(GLP)-1有53%的同源性,當(dāng)血糖水平高于正常時(shí),可降低血糖濃度。艾塞那肽通過促進(jìn)胰腺β細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)胰島素分泌,并通過減少胰高血糖素的分泌有效控制血糖水平。目前還沒有任何艾塞那肽口服制劑上市。本課題中,我們?cè)O(shè)計(jì)合成具有粘液穿透和腸靶向多功能化納米載體材料CSK-葡聚糖-聚(乳酸-乙醇酸)(CSK-DEX-PLGA),并以此為材料模型構(gòu)建艾塞那肽-Zn~(2+)復(fù)合物納米載藥口服遞送系統(tǒng),旨在解決艾塞那肽口服給藥生物利用度低的問題。利用DEX的正電性中和PLGA的負(fù)電性,使納米粒整體呈近似電中性,利于黏液層的穿透;CSK進(jìn)一步對(duì)DEX-PLGA進(jìn)行功能化修飾,使到達(dá)腸組織的CSK-DEX-PLGA-NPs(CDPs)易借助于CSK與杯狀細(xì)胞的親和性,提高跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率。本研究的主要內(nèi)容有艾塞那肽CDPs的制備及表征,體內(nèi)外靶向性相關(guān)評(píng)價(jià)以及藥代藥效學(xué)相關(guān)評(píng)價(jià),為建立高效、安全的口服多肽給藥遞送系統(tǒng)提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)論如下:1.嵌段聚合物CSK-DEX-PLGA的合成以CSK、DEX和PLGA為原料,利用葡聚糖末端葡萄糖分子異構(gòu)化(開環(huán))產(chǎn)生的醛基,與己二胺反應(yīng)生成席夫堿(亞胺)并轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)胺;然后,PLGA的-COOH端與琥珀酰亞胺發(fā)生反應(yīng),得到活化PLGA(PLGA-NHS);最后,PLGA的-COOH與胺化DEX的-NH_2反應(yīng)生成酰胺鍵。CSK的-COOH端用己二胺活化,然后與DEX-PLGA共聚物DEX端的-OH通過酰胺鍵連接,制備得到CSK-DEX-PLGA。采用核磁氫譜和GPC對(duì)合成材料進(jìn)行表征,并用HPLC檢測(cè)其反應(yīng)進(jìn)程。分析結(jié)果表明所制備的聚合物為CSK-DEX-PLGA。2.納米粒的制備與體外表征采用S/O/W復(fù)乳法制備納米粒,以粒徑、PI值、包封率、載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo),并通過單因素考察確定最優(yōu)處方及工藝為:初乳超聲功率300 w,初乳超聲時(shí)間30 s,外水相體積4 mL,外水相PVA濃度為3%(w/v),聚合物濃度為20 mg/mL,DMSO與二氯甲烷的比例為1:3,理論加藥量為1 mg。最優(yōu)處方CDPs的粒徑為136.3±8.9nm,zeta電位為0.15±0.019 mV,包封率為71.64±3.21%,載藥量為4.62±1.37%。于透射電鏡下觀察,納米粒呈球形,均勻分散,無黏連。分別采用含消化酶與不含消化酶的模擬胃液(SGF,pH 1.2)和模擬腸液(SIF,pH 7.4)對(duì)納米粒的穩(wěn)定性進(jìn)行考察,結(jié)果表明消化酶是影響藥物穩(wěn)定性的重要因素,且添加Zn~(2+)可以提高艾塞那肽的穩(wěn)定性。采用不含消化酶的模擬胃腸液進(jìn)行體外釋放行為考察,結(jié)果顯示將艾塞那肽包載于納米粒中可以提高其穩(wěn)定性,納米粒組沒有出現(xiàn)突釋現(xiàn)象且具有明顯的緩釋效果。3.體外細(xì)胞及粘液相關(guān)評(píng)價(jià)以Caco-2細(xì)胞為模型細(xì)胞,進(jìn)行體外細(xì)胞水平相關(guān)評(píng)價(jià)。采用MTT法對(duì)納米粒的毒性進(jìn)行考察,得出不同濃度DPs和CDPs對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖影響結(jié)果無差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所以沒有產(chǎn)生細(xì)胞毒性;采用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡對(duì)香豆素-6標(biāo)記納米粒(100 ng/mL)的體外細(xì)胞攝取情況進(jìn)行考察,研究結(jié)果顯示CDPs的被攝取能力強(qiáng)于DPs,但均是通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞;攝取抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明,香豆素-6標(biāo)記CDPs的被攝取涉及到網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白和脂筏介導(dǎo)的能量依賴途徑。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FITC-exenatide-CDPs的轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯高于FITC-exenatide-DPs;游離CSK的存在會(huì)降低FITC-exenatide-CDPs的轉(zhuǎn)運(yùn)量,證明CSK和CDPs與靶向結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,CDPs的轉(zhuǎn)運(yùn)量增加主要是由CSK肽和小腸杯狀細(xì)胞的特異性親和力所介導(dǎo)。采用鼠粘液平鋪于Transwell小室構(gòu)建粘液模型,通過細(xì)胞微孔板成像儀,定性定量的評(píng)價(jià)納米粒的粘液穿透性。結(jié)果表明,CDPs和DPs具有相似的粘液聚集率。而CDPs因表面附有呈負(fù)電性CSK的優(yōu)勢(shì),與負(fù)電性粘液的作用力稍弱。所以,CDPs粘液穿透率是DPs的2.1倍,表現(xiàn)出更為理想的粘液穿透性,并呈現(xiàn)差異顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.體內(nèi)分布相關(guān)評(píng)價(jià)通過小動(dòng)物活體成像系統(tǒng),定性評(píng)價(jià)Dir標(biāo)記CDPs在體內(nèi)的靶向吸收和分布效果�；铙w小鼠的觀察結(jié)果和離體器官(心、肝、脾、肺、腎、胃腸)的熒光強(qiáng)度變化表明,CDPs組的吸收和分布更快,對(duì)小腸部位具有較高的靶向性。腸上皮細(xì)胞滲透性實(shí)驗(yàn)和體外結(jié)扎腸環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,十二指腸、空腸和回腸處,尼羅紅標(biāo)記CDPs的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于DPs,CDPs的單位面積轉(zhuǎn)運(yùn)值約為DPs的1.5倍。以上結(jié)果均表明CDPs通過CSK的介導(dǎo)與小腸杯狀細(xì)胞特異性結(jié)合,并促進(jìn)其在小腸被吸收和體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)。5.藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)考察了不同劑型艾塞那肽在Sprague Dawley大鼠體內(nèi)的藥物代謝情況。建立體內(nèi)藥物含量的測(cè)定方法,采用艾塞那肽酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定大鼠的血藥濃度,并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。研究結(jié)果顯示,與皮下注射組相比,口服exenatide-Zn~(2+)-CDPs的生物利用度為9.2%;與艾塞那肽溶液口服給藥組相比,生物利用度提高了4倍,而且比exenatide-Zn~(2+)-DPs的生物利用度高1.61倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CSK能促進(jìn)CDPs與小腸杯狀細(xì)胞的靶向識(shí)別,提高艾塞那肽的口服給藥生物利用度。6.體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)采用db/db小鼠作為二型糖尿病模型,在動(dòng)物水平考察不同劑型艾塞那肽的藥理降血糖效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CSK修飾的CDPs在單次給藥和多次給藥中均表現(xiàn)出較明顯和持續(xù)的降血糖作用。酶聯(lián)免疫組化分析研究結(jié)果顯示,CDPs組的胰島素染色面積相比于口服艾塞那肽溶液組和DPs組是更高的,表明口服載艾塞那肽的CDPs可以改善胰腺β細(xì)胞的功能,并且促進(jìn)β細(xì)胞分泌胰島素。本研究成功的構(gòu)建載艾塞那肽CDPs,細(xì)胞和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)均充分證明功能化外源性CDPs具備提高粘液穿透率和腸道靶向性功能,提高了艾塞那肽的口服生物利用度,具有較明顯的降血糖效果。為艾塞那肽制備成治療二型糖尿病的口服制劑提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：煙臺(tái)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R943;R96

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本文編號(hào)：2668656