【摘要】：工程納米二氧化鈦(Titanium dioxide nanoparticles,TiO_2-NPs)廣泛用于環(huán)境、通信、材料和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,也作為添加劑分布在食物、牙膏、防曬霜等日用商品中。TiO_2-NPs主要經(jīng)消化道或呼吸道進(jìn)入人體并蓄積在肝和肺。已有研究表明,環(huán)境中各種來源的TiO_2-NPs暴露具有潛在遺傳和細(xì)胞毒性效應(yīng),但其在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的毒性機(jī)制尚未得到完整的詮釋。TiO_2-NPs遺傳毒性及作用機(jī)制的解析,對工程納米顆粒在環(huán)境、材料及日常生活中的安全應(yīng)用、防范其對人類潛在的負(fù)面健康效應(yīng)具有重要意義。TiO_2-NPs通過誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)而對細(xì)胞造成氧化脅迫。位于染色體末端、維持染色體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的端粒是胞內(nèi)ROS攻擊的重要靶標(biāo)之一,氧化脅迫可能誘使端粒長度(Telomere length,TL)異常,繼而導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定(Chromosome instability,CIN)及細(xì)胞死亡路徑改變。迄今為止,TiO_2-NPs對端粒的影響及分子機(jī)制尚未見系統(tǒng)報道。本研究根據(jù)TiO_2-NPs暴露后體內(nèi)吸收分布與代謝的主要途徑和靶器官特性,從細(xì)胞、染色體和分子等多層面,深入探討了TiO_2-NPs對人上皮來源的皮膚、肝臟和肺細(xì)胞的氧化脅迫效應(yīng),以及對端粒與染色體穩(wěn)定性的脅迫效應(yīng),綜合剖析了TiO_2-NPs的遺傳毒性與分子機(jī)制。(1)TiO_2-NPs對不同類型細(xì)胞的氧化脅迫效應(yīng):以人端粒酶陽性的肝細(xì)胞L-02、肝癌細(xì)胞QGY、肺細(xì)胞HBE及端粒酶陰性的皮膚細(xì)胞BJ為受試對象,分析TiO_2-NPs暴露后細(xì)胞ROS重要組分H_2O_2水平改變。結(jié)果顯示,TiO_2-NPs以時間(0~72h)和劑量(0~80μg/mL)依賴的方式進(jìn)入細(xì)胞,并引起胞內(nèi)H_2O_2水平顯著升高(P0.05);TiO_2-NPs暴露顯著誘導(dǎo)BJ、L-02細(xì)胞氧化還原平衡調(diào)控關(guān)鍵基因Nrf-2的mRNA表達(dá)下調(diào)(P0.01),QGY細(xì)胞Nrf-2表達(dá)上調(diào)(P0.01),HBE細(xì)胞未出現(xiàn)Nrf-2表達(dá)改變;實驗進(jìn)一步在80μg/mL的TiO_2-NPs中,加入20μg/mL的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC),進(jìn)行共暴露研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NAC僅在BJ細(xì)胞中降低了TiO_2-NPs誘發(fā)的ROS水平(P0.01)。研究提示,TiO_2-NPs暴露引起細(xì)胞氧化脅迫,而不同類型細(xì)胞的抗氧化能力存在差異,Nrf-2表達(dá)上調(diào)可能為增強(qiáng)細(xì)胞抗TiO_2-NPs脅迫效應(yīng)起到積極作用。(2)TiO_2-NPs對端粒及其維護(hù)機(jī)制的影響:將上述細(xì)胞暴露于40和80μg/mL的TiO_2-NPs 72h,以RT-qPCR法評價TiO_2-NPs對細(xì)胞TL的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TiO_2-NPs導(dǎo)致L-02、HBE和BJ細(xì)胞的TL顯著縮短(P0.05),QGY細(xì)胞TL未發(fā)生相應(yīng)改變。進(jìn)一步分析端粒維護(hù)相關(guān)的端粒酶活性組分h ETRT、端粒結(jié)合蛋白復(fù)合物shelterin的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)TiO_2-NPs顯著誘導(dǎo)HBE細(xì)胞hTERT表達(dá)下調(diào)(P0.05)、shelterin表達(dá)不變;BJ細(xì)胞shelterin表達(dá)上調(diào)(P0.05);L-02細(xì)胞hTERT、shelterin表達(dá)均顯著下調(diào)(P0.05);QGY細(xì)胞hTERT、shelterin表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05)。將hETRT、shelterin與Nrf-2表達(dá)對比分析,發(fā)現(xiàn)端粒酶陽性細(xì)胞中,Nrf-2與shelterin的表達(dá)趨勢一致,而端粒酶陰性的BJ細(xì)胞不存在類似對應(yīng)關(guān)系,提示端粒酶陽性細(xì)胞的Nrf-2可能正向影響shelterin的轉(zhuǎn)錄。Nrf-2高表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力,hTERT和shelterin表達(dá)上調(diào)可提高細(xì)胞的端粒維護(hù)作用,相反,當(dāng)Nrf-2表達(dá)下調(diào),hTERT表達(dá)下調(diào)/不表達(dá),shelterin表達(dá)也下調(diào)時,細(xì)胞抗氧化和端粒維護(hù)能力均被減弱,這可能是TiO_2-NPs暴露下,QGY細(xì)胞TL保持穩(wěn)定,而L-02、HBE和BJ細(xì)胞TL縮短的重要途徑。在20μg/mL NAC與80μg/mL TiO_2-NPs共暴露實驗中,NAC顯著抑制了TiO_2-NPs誘導(dǎo)的HBE、L-02和BJ細(xì)胞TL縮短(P0.01),提示細(xì)胞抗氧化能力的維護(hù)有利于TiO_2-NPs暴露下TL的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。(3)TiO_2-NPs對細(xì)胞和遺傳穩(wěn)定的影響:以胞質(zhì)分裂阻斷微核細(xì)胞組試驗(cytokinesis-block micronucleus cytome assay,CBMN-Cyt),評價TiO_2-NPs暴露對CIN、細(xì)胞死亡(凋亡和壞死)的影響。結(jié)果顯示,40和80μg/mL TiO_2-NPs暴露顯著誘導(dǎo)L-02、HBE和BJ細(xì)胞的CIN升高(P0.05),但不影響QGY細(xì)胞的CIN;TiO_2-NPs在四株受試細(xì)胞中均誘導(dǎo)壞死率顯著升高(P0.01)、與壞死相關(guān)的TNF-α、RIP3基因轉(zhuǎn)錄水平亦顯著升高(P0.05)。20μg/mL NAC與80μg/mL TiO_2-NPs共暴露實驗中,NAC顯著降低受試細(xì)胞中TiO_2-NPs誘發(fā)的CIN(P0.05)及細(xì)胞死亡(P0.05)。研究提示,TiO_2-NPs暴露誘導(dǎo)正常細(xì)胞的CIN升高與TL縮短顯著相關(guān),癌細(xì)胞與正常生理水平細(xì)胞的抗脅迫能力存在差異,高劑量TiO_2-NPs可能經(jīng)TNF-α-RIP3通路誘導(dǎo)細(xì)胞壞死,抗氧化劑NAC可對TiO_2-NPs相關(guān)遺傳毒性起到一定防范和減緩作用。(4)基于環(huán)境暴露濃度下的細(xì)胞和遺傳毒性分析:根據(jù)日常生活中人群TiO_2-NPs暴露劑量低且時間長的特點,研究模擬人群TiO_2-NOs暴露相近濃度(1~4μg/mL),選擇TiO_2-NPs體內(nèi)代謝、積累靶器官來源的L-02、HBE和QGY細(xì)胞處理12天,分析了細(xì)胞TL、CIN、細(xì)胞死亡的改變情況。結(jié)果顯示,L-02細(xì)胞中,1μg/mL的TiO_2-NPs暴露引起CIN、細(xì)胞死亡升高(P0.05),TL無顯著改變,4μg/mL的TiO_2-NPs暴露導(dǎo)致TL縮短、CIN和細(xì)胞死亡升高(P0.05);HBE細(xì)胞中,1μg/mL的TiO_2-NPs暴露引起TL延長(P0.05),CIN、細(xì)胞死亡無顯著改變,4μg/mL的TiO_2-NPs暴露誘導(dǎo)TL縮短、CIN和細(xì)胞死亡升高(P0.05);QGY細(xì)胞中,1和4μg/mL的TiO_2-NPs均誘導(dǎo)TL縮短和細(xì)胞死亡升高(P0.05),CIN無顯著改變。結(jié)果提示,不同類型細(xì)胞的TL、CIN和細(xì)胞死亡對低劑量TiO_2-NPs的敏感性存在差異,為了合理預(yù)警人群日常TiO_2-NPs暴露毒性限值及安全閾值,TiO_2-NPs的毒性評價應(yīng)當(dāng)考量不同組織及器官來源的細(xì)胞。綜上,TiO_2-NPs暴露引起胞內(nèi)ROS顯著升高,誘導(dǎo)細(xì)胞氧化脅迫;此時Nrf-2、hTERT和shelterin的表達(dá)上調(diào)是細(xì)胞提高抗氧化能力、維持TL和染色體穩(wěn)定的重要因素;如果TiO_2-NPs暴露誘導(dǎo)Nrf-2表達(dá)下調(diào)、hTERT不表達(dá)/表達(dá)下調(diào)、shelterin表達(dá)下調(diào),則會損傷細(xì)胞抗氧化、端粒維護(hù)機(jī)制,導(dǎo)致細(xì)胞端粒縮短和CIN率升高。高劑量TiO_2-NPs暴露還通過提高TNF-α-RIP3通路活性,誘導(dǎo)細(xì)胞壞死率上升。TiO_2-NPs暴露誘導(dǎo)的上述遺傳、氧化還原平衡負(fù)面效應(yīng)在一定程度上加速了細(xì)胞衰老,是TiO_2-NPs影響人類健康、增加遺傳-環(huán)境暴露相關(guān)疾病風(fēng)險的重要機(jī)制。適度的抗氧化干預(yù)可有效防范TiO_2-NPs暴露的遺傳毒性。
【圖文】：

27圖 1.2 TiO2-NPs 的主要毒性作用機(jī)制Figure 1.2 The main toxic mechanisms of TiO2-NPs總之，TiO2-NPs 通過引起胞內(nèi)大量 ROS 產(chǎn)生，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，破壞 DNA、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，引起胞內(nèi)主要細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)功能紊亂，展現(xiàn)其毒性作用（圖 1.2）。TiO2-NPs 還可以通過以上主要作用機(jī)制，激活胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因如 p53、NF-κB 通路、caspase 家族、Bax/Bcl-2，氧化損傷關(guān)鍵基因 Nrf-2、HO-1、SOD2，炎癥應(yīng)答相關(guān)基因如白細(xì)胞介素 IL 家族、TNF-α，改變胞內(nèi)氧化還原相關(guān)酶如SOD、SIR3、環(huán)氧合酶、GSH 的表達(dá)，產(chǎn)生氧化脅迫，影響如 DNA 修復(fù)等重要細(xì)胞功能，破壞遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，擾亂細(xì)胞周期進(jìn)程，影響基因組穩(wěn)定性，，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡及組織炎癥，誘發(fā)疾病甚至癌癥[1,204,219-221]。

和一個富含 G 的 3’ 末端懸突（3’overhang）即單鏈 DNA 區(qū)組成（圖1.3a）。端粒結(jié)合蛋白，也叫 shelterin 復(fù)合物，特異結(jié)合到端粒序列并使之形成端粒環(huán)，及 T 環(huán)（Telomere-loop，T-loop），以及位于 T 環(huán)內(nèi)的配對環(huán)（displacementloop，D-loop），幫助端粒成帽（telomere capping）。Shelterin 幫助端粒 DNA 形成的 D-loop-t-loop 套索樣結(jié)構(gòu)可有效掩飾染色體末端類似 DNA 雙鏈斷裂（DNAdouble-strand break）的結(jié)構(gòu)，避免其被 DNA 損傷機(jī)制識別
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R994.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2668531