【摘要】：篩選混合物庫發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)化合物較傳統(tǒng)逐一合成純化合物庫再篩選具有顯著成本和效率優(yōu)勢,前期建立了指數(shù)富集篩選混合物庫新技術(shù),為明確其篩選混合物庫中低豐度藥用級親和力配體的適用性,本文以磁珠固定結(jié)核分枝桿菌二氫葉酸還原酶(Mycobacterium tuberculosis DHFR,MtDHFR)為藥靶,建立了指數(shù)富集篩選混合物中低豐度MtDHFR高親和力配體體系,并初步應(yīng)用于組合合成及天然產(chǎn)物混合物中預(yù)期配體的篩選。表達(dá)靶蛋白Mt DHFR并Ni~(2+)-NTA磁珠固定化及表征;構(gòu)建N端帶6×His標(biāo)簽MtDHFR的表達(dá)質(zhì)粒pET28a:dfrA,在E.coli BL21(DE3)中成功重組表達(dá)并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。利用6×His標(biāo)簽與Ni~(2+)-NTA磁珠螯合固定6×His-MtDHFR,發(fā)現(xiàn)Ni~(2+)-NTA磁珠對MtDHFR固定化容量為(93±12)mg/g磁珠(n=3),但固定酶活性保留不超過32%;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Ni~(2+)顯著抑制酶活性,且EDTA與Ni~(2+)呈協(xié)同抑制效應(yīng),而Fe~(3+)無顯著干擾。通常Ni~(2+)-NTA鰲合帶6His標(biāo)簽酶復(fù)合物在pH 8.0及以上才能維持穩(wěn)定;但6His-Mt DHFR在pH 8.0時保留的活性很低。因此,Ni~(2+)-NTA磁珠鰲合固定方案不適于固定化MtDHFR用于磁分離篩選配體混合物庫。羧基磁珠固定化MtDHFR及表征。晶體結(jié)構(gòu)(PDB code:4KNE)顯示,Mt DHFR氨基酸序列僅有1個賴氨酸(Lys-53)及N端伯氨基,都遠(yuǎn)離活性位點,因此,可通過此氨基與磁珠表面活化羧基生成酰胺固定化。羧基磁珠固定化MtDHFR的容量為(8.6±0.6)mg/g磁珠(n=3),相對于游離酶活性,固定酶保留活性(87±4)%(n=3);游離和固定化MtDHFR在反應(yīng)緩沖液中0℃保存16 h活性都無顯著改變,但在25℃保存16 h,游離酶活性下降近60%,羧基磁珠固定化MtDHFR活性下降僅約35%,可見固定酶儲存穩(wěn)定性比游離酶顯著提高,且MtDHFR羧基磁珠固定前后對抑制劑甲氨蝶呤(MTX)的IC_(50)無顯著性差異(P0.05)。因此,此羧基磁珠固定化MtDHFR方案滿足配體混合物庫中高親和力配體的選擇性指數(shù)富集與篩選要求�；诠潭ɑ疢t DHFR為靶指數(shù)富集篩選配體混合物體系建立及初步應(yīng)用。以典型抑制劑MTX為母體設(shè)計合成不同親和力的系列衍生物。通過人工混合構(gòu)成含MTX約1%的模擬混合物,外加參考配體,構(gòu)成篩選前樣品。以羧基磁珠固定MtDHFR為靶,通過降低靶蛋白用量至配體平均結(jié)合率低于10%,并使配體混合物發(fā)生競爭結(jié)合而選擇性富集高親和力配體,以前一輪提取所得配體混合物用于后一輪的篩選前樣品,連續(xù)兩輪迭代篩選,驗證了含量為1%的高親和力配體MTX的指數(shù)富集效應(yīng)。進(jìn)一步以MTX和芳酸混合物與胺及醇混合物組合合成成分復(fù)雜的含有痕量殘留MTX的混合物,應(yīng)用此系統(tǒng)經(jīng)過兩輪迭代篩選,實現(xiàn)了痕量殘留MTX的指數(shù)富集。以中藥材姜黃提取物,適當(dāng)稀釋后外加痕量候選配體MTX和參考配體組成天然產(chǎn)物模擬混合物篩選前樣品,同樣經(jīng)兩輪篩選可實現(xiàn)選擇性富集天然產(chǎn)物混合物中的高親和力痕量MTX。綜上所述,通過重組表達(dá)Mt DHFR并優(yōu)化磁珠固定化方案,在模擬混合物驗證了預(yù)期高親和力配體的指數(shù)富集效應(yīng),并成功應(yīng)用于組合合成混合物及天然混合物中含量低于1%親和力為納摩爾級配體的選擇性富集篩選。由此明確了磁分離迭代指數(shù)富集篩選混合物中痕量納摩爾級親和力藥用配體的適用性,進(jìn)一步優(yōu)化將有望用于從現(xiàn)有抗結(jié)核活性中草藥中發(fā)現(xiàn)高親和力先導(dǎo)配體。
【圖文】：

圖 1-1 質(zhì)粒 pET28a-4KNE 圖譜Fig. 1-1 Map of Plasmid pET28a-4KNE圖 1-2重組MtDHFR基因序列比對(A)和氨基酸序列比對(B)Fig.1-2 Gene sequence (A) and amino acidsequence alignment (B) of recombinantMtDHFR Sequence0:重組序列；Sequence1:GenBank(Gene ID: 887777)，PDB(4KNE)3.2 MtDHFR 表達(dá)和純化

質(zhì)粒 pET28a(+):dfrA(圖 1-1)經(jīng)轉(zhuǎn)化后挑單克隆菌進(jìn)行測序鑒定，通過DNAssist Version 2.2 比對，其結(jié)果與 GenBank 中結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)全基因組數(shù)據(jù)庫檢索的基因序列一致 (圖1-2A)，其編碼氨基酸序列與重組MtDHFR的氨基酸序列同源性達(dá) 100% (圖 1-2B)；因此，，可以確定 dfrA 基因已成功克隆到載體pET28a，質(zhì)粒構(gòu)建正確。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R914

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