【摘要】：苔蘚(包括苔綱、蘚綱、角苔綱)處于植物由水生向陸生過渡的階段,是最早的陸生植物;它在進(jìn)化分類上介于藻類和維管植物之間,也是最低等的高等植物。苔蘚能產(chǎn)生大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物,尤其是苔類植物,幾乎所有的苔類細(xì)胞中都存在油體,其中含有異常豐富的萜類及芳香類化合物。這些成分不僅結(jié)構(gòu)多樣,而且具有廣泛的生物學(xué)活性,諸如抗細(xì)菌、抗真菌、抗氧化、殺蟲等等�；谄涮厥獾倪M(jìn)化地位以及富含結(jié)構(gòu)獨(dú)特且生物活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物,苔類植物值得被深入研究。相比苔蘚植物化學(xué)的飛速發(fā)展,其生物學(xué)方面的研究就顯得相對(duì)落后,所以本文從分子生物學(xué)的角度,以基因克隆、代謝工程為手段,對(duì)苔類植物次級(jí)代謝途徑上的關(guān)鍵酶以及重要次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究,一方面可以從微觀角度闡明苔類植物的起源進(jìn)化,另一方面也能為用生物手段提高生物活性成分的含量奠定理論基礎(chǔ)。苔類植物富含芳香化合物,其中包括苔類所特有的結(jié)構(gòu)獨(dú)特的大環(huán)雙聯(lián)芐類,這些化合物擁有良好的生物學(xué)活性。前人通過同位素追蹤法,推測(cè)出雙聯(lián)芐類化合物與高等植物中的黃酮均來(lái)自苯丙素和聚酮生物合成途徑,它們共用一套酶體系。bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物體內(nèi)多種重要生物學(xué)過程,尤其是Ⅲf亞類在高等植物中能調(diào)節(jié)黃酮類的生物合成。由此推斷,Ⅲf亞類的bHLH轉(zhuǎn)錄因子在苔類中可能參與調(diào)控雙聯(lián)芐類的生物合成。前期實(shí)驗(yàn)從鈍鱗紫背苔中克隆得到一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子PabHLH,并通過轉(zhuǎn)化鈍鱗紫背苔的愈傷組織,初步證明其可能對(duì)雙聯(lián)芐類化合物在苔中的積累有調(diào)控作用。本文研究發(fā)現(xiàn)鈍鱗紫背苔三種不同組織中雙聯(lián)芐類成分的含量與其中的PabHLH基因表達(dá)水平呈正相關(guān)。高等植物bHLH會(huì)對(duì)外界壓力產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄應(yīng)激,當(dāng)對(duì)鈍鱗紫背苔材料施加外源激素SA或者M(jìn)eJA時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)PabHLH的強(qiáng)烈表達(dá)。序列比對(duì)顯示,PabHLH雖與高等植物bHLH的相似度很低,但是它仍具有保守的bHLH區(qū)域,并且在進(jìn)化樹分析時(shí),PabHLH與高等植物的Ⅲf亞類bHLH轉(zhuǎn)錄因子聚為一簇。用前期構(gòu)建的PabHLH植物過表達(dá)以及RNAi載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化鈍鱗紫背苔的葉狀體組織,對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)。葉狀體中主要的雙聯(lián)芐成分片葉苔素D(RD)在過表達(dá)克隆中產(chǎn)量增加,在RNAi克隆中產(chǎn)量降低。這一結(jié)果也與轉(zhuǎn)基因葉狀體粗提物對(duì)白色念珠菌菌絲形成抑制實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)象相對(duì)應(yīng);同樣地,葉狀體中的總黃酮成分在過表達(dá)克隆中積累,在RNAi克隆中減少。分析轉(zhuǎn)基因愈傷以及葉狀體克隆中雙聯(lián)芐及黃酮生物合成通路上各結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,PabHLH在苔類植物中通過影響PAL、4CL1、STCS1、CHS、P450-3、P450-4、CHS以及FNSI的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)雙聯(lián)芐以及黃酮含量的調(diào)控。在應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境時(shí),除了合成生物活性分子,苔蘚植物還發(fā)展了自己的抗氧化、脫毒機(jī)制。α,β-不飽和雙鍵還原酶能高效地催化還原脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的具有細(xì)胞毒性的產(chǎn)物。所以α,β-不飽和醛酮雙鍵還原酶在抗氧化、脫毒方面發(fā)揮了重要作用。本文從粗裂地錢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)注釋為α,β-不飽和雙鍵還原酶的序列,分別命名為MpDBR1和MpDBR2,通過3'-RACE、5'-RACE及其它克隆手段得到兩個(gè)基因的全長(zhǎng)克隆。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)MpDBR1和MpDBR2都具有中鏈脫氫酶/還原酶(MDR)家族的AXXGXXG和GXXS保守域,但是它們兩個(gè)的整體相似度卻較低。進(jìn)化樹分析也顯示MpDBR1和MpDBR2歸屬于不同的進(jìn)化分支,MpDBR1與其它植物中已鑒定的雙鍵還原酶歸于一類,而MpDBR2則與真菌中的雙鍵還原酶親緣關(guān)系較近,這類雙鍵還原酶從未在其它植物中發(fā)現(xiàn)過。分別構(gòu)建了 MpDBR1和MpDBR2的原核表達(dá)載體,表達(dá)蛋白并純化,進(jìn)行體外酶活功能以及酶學(xué)特性的分析。結(jié)果顯示,它們均具有氫化還原α,β-不飽和雙鍵的功能,但是它們的酶學(xué)特性卻存在差異,MpDBR1的最適溫度和最適pH為37℃和6.5,MpDBR2的卻為20℃和7,MpDBR2對(duì)溫度尤其敏感。闡明了苔類植物中至少存在兩個(gè)亞類的雙鍵還原酶,也揭示了苔類植物中基因的多樣性。為了適應(yīng)由水生環(huán)境向陸生環(huán)境過渡的需要,苔蘚植物在其生理方面發(fā)生了相應(yīng)的變化。自然界中木質(zhì)素的出現(xiàn)被認(rèn)為是植物由水生向陸生生活方式轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素。盡管木質(zhì)素是否真正存在仍然有爭(zhēng)議,但現(xiàn)在普遍認(rèn)為苔蘚中包含“不凝聚”的木質(zhì)素單體類分子,同時(shí)木脂素成分也在苔蘚中被分離得到。羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCT)在高等植物中參與木質(zhì)素木脂素單體分子的生物合成,但是HCT在苔類中的功能還未被研究過。本文從粗裂地錢和鈍鱗紫背苔的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到了兩個(gè)注釋為羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶的基因,分別克隆并命名為MpHCT和PaHCT。與其它高等植物已鑒定的HCT進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)MpHCT和PaHCT均具有BAHD轉(zhuǎn)移酶家族的特征性保守區(qū)域,HXXXD和DFGWG;并且和其它HCT具有很高的相似性,除了 MpHCT和PaHCT序列的中間位置比高等植物HCT長(zhǎng)了100個(gè)氨基酸的片段。進(jìn)化樹分析表明,MpHCT和PaHCT處于較古老的進(jìn)化地位,并且與小立碗蘚中的PpHCT具有最近的親緣關(guān)系,其次是江南卷柏中的SmHCT。構(gòu)建截短體MpHCT-Tr、PaHCT-Tr,與真實(shí)的序列較短的SmHCT一起,對(duì)MpHCT和PaHCT中長(zhǎng)出片段的功能作用進(jìn)行研究。體外酶活結(jié)果顯示,無(wú)論是比活性還是酶學(xué)動(dòng)力學(xué)分析,長(zhǎng)的HCT與短的HCT所表現(xiàn)出來(lái)的底物選擇性是一致的,它們都能接受對(duì)羥基肉桂酰CoA、咖啡酰CoA、阿魏酰CoA作為�；w,莽草酸、奎尼酸作為�；荏w,并且對(duì)羥基肉桂酰CoA和莽草酸是它們的最適底物;同時(shí),它們對(duì)底物的催化效率也都是類似的。全長(zhǎng)HCT與截短HCT體內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞,結(jié)果顯示兩者均能使煙草葉片中綠原酸和隱綠原酸總量增加;而它們?cè)阝g鱗紫背苔葉狀體中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,也顯示出全長(zhǎng)HCT與截短HCT均能引起苔類植物中類木質(zhì)素樣成分的積累。綜上說(shuō)明,苔類植物HCT基因中長(zhǎng)出的一段序列并不參與酶的功能催化。構(gòu)建MpHCT、PaHCT、MpHCT-Tr、PaHCT-Tr和SmHCT的亞細(xì)胞定位載體,分別轉(zhuǎn)化煙草葉片觀察,三個(gè)短的HCT同時(shí)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,兩個(gè)長(zhǎng)的HCT只定位于細(xì)胞質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明,苔類植物中存在真正的功能性HCT基因,它較高等植物HCT長(zhǎng)出的一段基因序列與它的亞細(xì)胞定位有關(guān)。
【圖文】：

邐Ｐｅｒｒｏｔｔｅｔｉｎ邋Ｅ．邋８邐２邋ｘ邋Ｌｕｎｕｌａｒｉｎ，，邋９逡逑圖１．１大環(huán)雙聯(lián)芐的主要結(jié)構(gòu)類型［１６］逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｇｅｎｅｒａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ邋ｂｉｓｂｉｂｅｎｚｙｌ邋ｎａｔｕｒａｌ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ．逡逑迄今為止已經(jīng)從苔類植物中發(fā)現(xiàn)了一百多種大環(huán)雙聯(lián)芐。一般來(lái)說(shuō)氧化偶聯(lián)逡逑作用會(huì)降低抗真菌劑的作用但是大環(huán)雙聯(lián)芐卻比它相應(yīng)單體的抗真菌活性更逡逑強(qiáng)。例如，羽苔素Ｅ對(duì)白色念珠菌比半月苔素展現(xiàn)出更強(qiáng)的抗真菌活性，它們逡逑的ＭＩＣ值分別是１６和６４邋ｐｇ／ｍＵ１７］。地錢素Ａ，作為第一個(gè)從自然界發(fā)現(xiàn)的大逡逑１４逡逑

逡逑個(gè)螺旋的位置（圖１．４）。堿性區(qū)域包含１５－１７個(gè)氨基酸，它們與ＤＮＡ的結(jié)合有逡逑關(guān)。擬南芥中２０％的ｂＨＬＨ轉(zhuǎn)錄因子因?yàn)槿狈@個(gè)堿性區(qū)域，形成異源二聚體逡逑而無(wú)法結(jié)合ＤＮＡ，從而發(fā)揮抑制作用［４９］。逡逑ｂＨＬＨ蛋白能結(jié)合典型的順式元件Ｅ－ｂｏｘ（５’－ＣＡＮＮＴＧ－３’），變異型的Ｇ－ｂｏｘ逡逑（５’－ＣＡＣＧＴＧ－３’）是它最常識(shí)別的序列。擬南芥中，兩個(gè)堿性區(qū)域的氨基酸Ｇｌｕｌ３逡逑和Ａｒｇｌ６形成Ｅ－ｂｏｘ識(shí)別區(qū)域，從而發(fā)揮ＤＮＡ結(jié)合作用＿。事實(shí)上，Ｇｌｕｌ３直逡逑接與Ｅ－ｂｏｘ中的ＣＡ堿基結(jié)合，而Ａｒｇｌ６則是輔助Ｇｌｕｌ３的結(jié)合與維持穩(wěn)定。對(duì)逡逑于Ｇ－ｂｏｘ的結(jié)合，則是通過Ｈｉｓ／Ｌｙｓ９，ＧｌｕＩ３和Ａｒｇｌ７，即ＨＥＲ區(qū)域來(lái)完成的。逡逑Ａｒｇｌ７與內(nèi)側(cè)的堿基Ｇ結(jié)合
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R914


本文編號(hào)：2666988