【摘要】：刺激響應(yīng)的納米藥物載體在藥物可控釋放中具有廣泛的應(yīng)用。由于細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境,氧化還原敏感納米膠束可用于藥物緩控釋放中,因此氧化還原敏感膠束是重要的應(yīng)答型納米載體。在藥物遞送過程中,藥物分子可以通過物理或化學(xué)方式包載于膠束中。由于細(xì)胞質(zhì)中谷胱甘肽(GSH)的濃度比細(xì)胞外高約1000倍,與載體以共價(jià)鍵連接的藥物可以有效地避免藥物在系統(tǒng)循環(huán)過程中提前釋放。然而,氧化還原敏感膠束面臨的一個(gè)重要問題是藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放相對(duì)緩慢,因此會(huì)使治療作用延緩。目前來看,導(dǎo)致這種現(xiàn)象的一個(gè)原因是親水性的GSH需要克服擴(kuò)散屏障進(jìn)入聚合物膠束疏水性內(nèi)核,另一個(gè)原因是GSH與二硫鍵的交換反應(yīng)動(dòng)力學(xué)具較慢。氧化還原敏感膠束中藥物釋放的速率對(duì)于治療效果至關(guān)重要,藥物釋放動(dòng)力學(xué)的體外評(píng)估經(jīng)常依賴于色譜類的非在線方法,但是這些方法耗時(shí)長,價(jià)格昂貴,并且不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物釋放。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)獨(dú)特的機(jī)制,可使具有熒光效應(yīng)的藥物在納米級(jí)范圍內(nèi)的分子聚合-解聚過程發(fā)生熒光信號(hào)的變化,從而檢測(cè)藥物從膠束中的釋放。而目前,FRET技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于體內(nèi)以及體外藥物釋放的檢測(cè),然而FRET技術(shù)面臨的一大問題是傳統(tǒng)發(fā)光色團(tuán)會(huì)由于聚集而發(fā)生熒光淬滅,即聚集引起的淬滅(ACQ)效應(yīng)。與ACQ相比,聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)(AIE)是一種相反的特殊發(fā)光現(xiàn)象。某些有機(jī)發(fā)光分子在聚集狀態(tài)中顯示出比分散在溶液中更高的量子產(chǎn)率(光致發(fā)光效率)。AIE現(xiàn)象通常被認(rèn)為是探針聚集時(shí),分子運(yùn)動(dòng)受到限制的結(jié)果。AIE探針相對(duì)于傳統(tǒng)的ACQ染料具有明顯的優(yōu)勢(shì),因?yàn)樗鼈冇懈叻直�、抗漂白和較大的斯托克斯移位等優(yōu)點(diǎn)。因此,AIE探針和FRET的結(jié)合使用能夠提供一種熒光敏感的“開關(guān)”技術(shù),并且在化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用�；谝陨媳尘�,該課題計(jì)劃將模型藥與氧化還原敏感的聚合物膠束通過二硫鍵相連接,而AIE探針和FRET技術(shù)的結(jié)合使用可以實(shí)現(xiàn)對(duì)該聚合物膠束藥物釋放的原位檢測(cè)。本課題以聚乙二醇-聚賴氨酸(mPEG-PLys)為骨架,具有熒光效應(yīng)的姜黃素(Cur)作為模型藥物,經(jīng)典的AIE探針-四苯基乙烯(TPE)作為FRET供體,姜黃素(Cur)作為FRET受體,以此構(gòu)成聚合物。本文的研究目的是將FRET技術(shù)和AIE探針聯(lián)合使用在同一氧化還原敏感的納米膠束載體中,對(duì)膠束中姜黃素釋放動(dòng)力學(xué)進(jìn)行原位研究監(jiān)測(cè)。目標(biāo)共軛聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE的合成主要涉及到三個(gè)片段(聚合物骨架、TPE衍生物、Cur衍生物)的連接。TPE衍生物(TPE-OH和TPE-COOH)的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過氫譜、碳譜以及質(zhì)譜得到了證實(shí)。聚合物的合成利用mPEG-NH_2作為大分子引發(fā)劑,誘導(dǎo)N-羧基-環(huán)內(nèi)酸酐(NCA)單體,即N6-芐氧羰基-L-賴氨酸環(huán)內(nèi)酸酐(Lys(Z)-NCA)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)。隨后,聚合物mPEG-PLys(Z)的末端氨基與TPE-COOH的羧基發(fā)生縮合反應(yīng),形成TPE修飾的聚合物,即mPEG-PLys(Z)-TPE。mPEG-PLys(Z)-TPE脫去芐基保護(hù)基后在側(cè)鏈形成游離氨基,能夠與姜黃素(Cur)進(jìn)行連接。姜黃素衍生物Cur-SS-COOH的結(jié)構(gòu)通過核磁共振和質(zhì)譜分析手段得到了證實(shí)。最終的目標(biāo)聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE的結(jié)構(gòu)通過核磁共振得到了確認(rèn),共軛分子量最終確定為8,479 Da。由于Cur(log P=3.2)和TPE(log P=8.0)具有較高的疏水性,它們與多肽相連可以形成疏水區(qū),而外層PEG功能性基團(tuán)可形成親水區(qū)。mPEG-PLys(Cur)-TPE的雙親性特征能夠使其自組裝形成納米載體膠束。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析顯示其流體力學(xué)粒徑大小為129±12 nm;臨界膠束濃度(CMC)為8.7±0.3μg/mL(1.03±0.03μM),低CMC數(shù)值代表了膠束具有良好的穩(wěn)定性,可以保證膠束在體循環(huán)中的完整性。確定膠束的CMC通常需要使用外源性探針(例如芘熒光探針)。由于Cur和TPE都具有熒光性,因此該特性可以用于無探針方法的CMC分析。但由于TPE和Cur可以作為一個(gè)完美的FRET熒光對(duì),當(dāng)用低波長激發(fā)時(shí),作為FRET供體的TPE熒光會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移,因此可以選擇利用Cur熒光來確定CMC,從而避免FRET效應(yīng)的影響。與對(duì)照聚合物mPEG-PLys(Z)相比,聚合物mPEG-PLys(Cur)-TPE以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑時(shí),在500 nm以下波長內(nèi)展現(xiàn)出很強(qiáng)的光譜吸收,這是由于Cur和TPE與mPEG-PLys(Z)發(fā)生共軛的結(jié)果。當(dāng)用水取代DMF時(shí),mPEG-PLys(Cur)-TPE聚合物會(huì)自組裝成膠束,自組裝后,體系中的Cur與TPE會(huì)包裹進(jìn)膠束疏水空腔內(nèi)部,吸收強(qiáng)度減小。水相膠束體系自由(非組裝)聚合物與聚集(組裝)聚合物之間存在著動(dòng)態(tài)平衡,因此水相膠束的最大吸收波長與有機(jī)溶液中的最大吸收波長相比會(huì)降低。為了檢測(cè)聚合物膠束的AIE性能,我們將DMF按照不同的比例添加到mPEG-PLys(Z)-TPE膠束的懸浮液中。結(jié)果表明,聚合物膠束在混合溶液中表現(xiàn)出了不同的穩(wěn)定性:DMF的比例越高,聚合物膠束的穩(wěn)定性越低。隨著DMF比例的增加,AIE效應(yīng)逐漸減弱,這是因?yàn)榫酆衔锬z束發(fā)生解體進(jìn)而TPE分子分散。作為對(duì)照物,TPE衍生物(TPE-COOH)也同樣顯示出了優(yōu)異的AIE效應(yīng)。此外,我們對(duì)mPEG-PLys(Cur)-TPE在水/DMF混合溶劑中的發(fā)射光譜進(jìn)行了檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AIE效應(yīng)隨著FRET效應(yīng)的減弱而逐漸消失,ACQ效應(yīng)也隨著藥物(Cur)的釋放而消失。為了檢測(cè)mPEG-PLys(Cur)-TPE膠束的FRET效應(yīng),我們首先測(cè)定了TPE的發(fā)射光譜和Cur的吸收光譜,對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩圖有很大的重疊部分,證實(shí)了TPE和Cur可以作為優(yōu)良的FRET對(duì)。然而,這兩種光譜并沒有完全疊加,因此TPE作為FRET供體在最大吸收波長(349 nm)處激發(fā)時(shí),mPEG-PLys(Cur)-TPE膠束的激發(fā)光譜包含兩個(gè)部分。其中一部分是由TPE的局部發(fā)射而激發(fā)Cur的發(fā)射,另一部分是不能夠激發(fā)Cur的TPE殘留部分的發(fā)射。這就導(dǎo)致了兩種發(fā)射光譜在349 nm和462 nm(即Cur的最大激發(fā)波長)之間的形狀差異。由于mPEG-PLys(Cur)-TPE膠束在462 nm波長條件下只能激發(fā)Cur發(fā)射,所以在462 nm波長條件下激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射光譜強(qiáng)度較小。本研究中引入的FRET機(jī)制是通過相互驗(yàn)證的方法產(chǎn)生兩個(gè)相關(guān)的熒光信號(hào),從而使Cur的釋放動(dòng)力學(xué)“可視化”。由于ACQ效應(yīng)的減弱,Cur的熒光強(qiáng)度隨著從膠束載體中的釋放而增大。TPE的存在(作為FRET供體)為藥物釋放性能的檢測(cè)提供了額外的信息。當(dāng)膠束完好無損時(shí)(沒有Cur釋放),從TPE到Cur的能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致TPE的熒光效應(yīng)減弱。隨著Cur的穩(wěn)定釋放,FRET現(xiàn)象變得不再明顯,而TPE又逐漸恢復(fù)了熒光效應(yīng)。在生理?xiàng)l件下,二硫鍵具有一定的穩(wěn)定性,但在細(xì)胞質(zhì)中GSH作用下會(huì)發(fā)生斷裂。因此,本研究中使用濃度為10 mM的GSH來模擬細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境。理論上,二硫鍵斷裂后模型藥物Cur被釋放,ACQ現(xiàn)象減弱。此外,FRET效應(yīng)失去受體,來自供體(TPE)的發(fā)射會(huì)更加“可視化”,而實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也很好地支持上述推測(cè)。TPE和Cur的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的推移而增加。值得注意的是,由于藥物的水溶性較差(1μg/mL),因此為了溶解從膠束中釋放的Cur,該體系中加入5%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)。GSH引發(fā)氧化還原敏感聚合物膠束藥物釋放持續(xù)了幾個(gè)小時(shí),這主要是因?yàn)槎蜴I和硫醇交換過程極為緩慢。親水性的GSH(logP=-4.5)進(jìn)入疏水性的膠束內(nèi)核會(huì)帶來額外的擴(kuò)散屏障。膠束的吸收強(qiáng)度隨時(shí)間推移而增強(qiáng),這是藥物釋放的結(jié)果。隨著Cur的釋放,膠束的粒徑也慢慢增大。這是因?yàn)镃ur的釋放改變了兩親性聚合物的親水/疏水鏈段比例,降低了膠束自組裝的驅(qū)動(dòng)力。由于GSH誘發(fā)藥物從納米載體的釋放是一個(gè)相當(dāng)緩慢的過程,本研究還使用了另一種還原分子(TCEP),這種分子能夠在幾分鐘之內(nèi)使二硫鍵迅速斷裂。類似地,在加入TCEP后,TPE和Cur發(fā)射光譜的強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而增加,這是由于FRET效應(yīng)受到了破壞或削弱,而且光譜出現(xiàn)顯著變化的時(shí)間也由幾小時(shí)縮短到幾分鐘。這主要是因?yàn)橐氲腡CEP采用了不同的機(jī)制來切斷二硫鍵,從而克服了二硫鍵和硫醇交換的動(dòng)力學(xué)障礙。膠束的吸收譜隨著時(shí)間的推移強(qiáng)度不斷增大,動(dòng)力學(xué)粒度分析顯示膠束粒徑不斷膨脹,這也與FRET熒光結(jié)果分析保持一致。該現(xiàn)象是由于藥物釋放引起,疏水性藥物的釋放導(dǎo)致聚合物的疏水性減弱,顆粒膨脹或聚集。已有報(bào)道顯示聚合物兩親性比例的變化能夠引起膠束粒徑的改變。通過測(cè)定膠束在10 mM的GSH(2 h和24 h)或10 mM的TCEP(2h)作用下的膠束CMC,分別對(duì)斷裂二硫鍵,誘導(dǎo)Cur釋放的效率進(jìn)行了評(píng)估。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明顯看出,在相同濃度條件下(10 mM)用TCEP處理2 h與用GSH的處理24 h產(chǎn)生CMC結(jié)果相同,這說明TCEP還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于GSH,對(duì)于二硫鍵的斷裂具有更高的效率。此外,我們還對(duì)細(xì)胞水平的藥物釋放進(jìn)行了評(píng)估。利用人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)對(duì)該氧化還原敏感膠束的治療效果進(jìn)行考察。由于GSH是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)源性物質(zhì),因此不需要補(bǔ)加額外的GSH。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)分析結(jié)果表明,TPE和Cur的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移而增加,這是由于GSH引發(fā)的Cur釋放而導(dǎo)致Cur和TPE之間的FRET效應(yīng)隨之下降的結(jié)果。利用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定了不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞累積釋放量的百分率,與熒光強(qiáng)度分析結(jié)果一致。此外,流式細(xì)胞儀分析也顯示了同樣的趨勢(shì)。這一趨勢(shì)也完全符合在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的體外釋放研究結(jié)果。PBS和細(xì)胞質(zhì)的藥物釋放時(shí)間間隔與二硫鍵和硫醇交換反應(yīng)緩慢相吻合。相比之下,當(dāng)MCF-7細(xì)胞以相同劑量的單一TPE或Cur處理時(shí),TPE或Cur的熒光強(qiáng)度在相同時(shí)間內(nèi)沒有明顯改變,這是因?yàn)檫@兩種條件下都沒有出現(xiàn)FRET現(xiàn)象。用GSH或丁硫氨酸亞砜胺(BSO)預(yù)處理的細(xì)胞分別作為陽性和陰性的對(duì)照。增加細(xì)胞內(nèi)GSH可以加速藥物釋放,相應(yīng)地TPE與Cur的熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)。相反的,用BSO的預(yù)處理會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)GSH的含量,從而使影響熒光效應(yīng)的釋放動(dòng)力學(xué)變化緩慢。雖然TCEP比GSH具有更高效二硫鍵的斷裂能力,但它一般不能通過細(xì)胞膜,因此本文沒有開展細(xì)胞內(nèi)TCEP介導(dǎo)Cur釋放的相關(guān)研究。有趣的是,在細(xì)胞內(nèi)的藥物釋放過程中,TPE熒光強(qiáng)度的增加與時(shí)間增加成較好的線性關(guān)系,這一結(jié)果與Cur熒光強(qiáng)度變化形成了鮮明的對(duì)比,Cur熒光強(qiáng)度增加與時(shí)間的增加并沒有呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系。這一現(xiàn)象主要?dú)w因于TPE的高分辨率和抗光漂白性。TPE基團(tuán)的存在不僅利于熒光藥物原位釋放的監(jiān)測(cè),而且為非熒光劑的釋放提供了信息。單一的TPE在高達(dá)21μg/mL濃度下也沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性,共價(jià)連接Cur的膠束和單一Cur的IC_(50)分別為40.9±2.8和18.3±1.6μg/mL。這些結(jié)果表明該膠束的細(xì)胞毒性是由Cur而非TPE產(chǎn)生的。綜上所述,我們通過FRET和AIE的結(jié)合使用成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)氧化還原敏感聚合物膠束中的姜黃素釋放的原位監(jiān)測(cè)。引入的AIE分子作為FRET供體可以解決由分子染料聚集而引起的熒光淬滅效應(yīng)。由GSH或TCEP誘發(fā)PBS溶液內(nèi)藥物釋放可以引起FRET供體和受體熒光效應(yīng)的增強(qiáng),但TCEP在二硫鍵的斷裂上顯得更加高效。另外,在MCF-7細(xì)胞中也觀察到相同的趨勢(shì)。由于短激發(fā)波長的組織穿透能力有限,目前無法在體內(nèi)進(jìn)行原位藥物釋放監(jiān)測(cè)的相關(guān)研究。但當(dāng)藥物和AIE探針的激發(fā)波長位于近紅外范圍內(nèi)時(shí),這種策略可用于原位評(píng)估體內(nèi)藥物釋放。目前的研究顯示了Cur與AIE結(jié)合使用的潛力,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)刺激敏感型納米藥物釋放的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2667083