【摘要】：線粒體是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)。通過給藥系統(tǒng)載體的主動(dòng)靶向修飾,可實(shí)現(xiàn)靶向線粒體的藥物高效遞送,最大限度降低脫靶效應(yīng),實(shí)現(xiàn)藥物的高效低毒治療。本研究致力于利用腫瘤細(xì)胞線粒體的特殊病理內(nèi)環(huán)境特性,以及采用外源性刺激等方式,設(shè)計(jì)智能化納米給藥系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)線粒體高效靶向及敏感釋放。選用可生物降解海洋生物材料陽離子殼聚糖(Chitosan,CSO)為基本骨架,嫁接親脂性硬脂酸(Stearic acid,SA),構(gòu)建陽離子殼聚糖硬脂酸嫁接物(Stearic acid grafted chitosan,CSOSA),進(jìn)行親脂性陽離子四羧丁基三苯基膦((4-carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide,CTPP)化學(xué)修飾,得到CTPP修飾CSOSA嫁接物(CTPP modified stearic acid-g-chitosan,C-P-CSOSA)。優(yōu)選CTPP修飾比例為3.88%的C-P-CSOSA,該嫁接物可在水中自聚集形成膠束,且具有較強(qiáng)的質(zhì)子緩沖能力。細(xì)胞攝取研究結(jié)果顯示,MMF-7腫瘤細(xì)胞的的-P--SOSA攝取,明顯高于于正肝L02細(xì)胞。。TPP主動(dòng)靶向修飾,可進(jìn)嫁接物物束更多地經(jīng)內(nèi)在化進(jìn)進(jìn)腫瘤胞,從溶酶體中快速逃逸,靶向腫瘤細(xì)胞線粒體。以阿霉素(Dooorubicin,DOXX為模型藥物,透析法制備線粒體靶向給藥系統(tǒng)統(tǒng)-P-SOSA/DOXX經(jīng)測(cè)定,,-P--SOSA/DOX粒徑徑為67.222.82 nm,表面電位位18.7±1.78mV。-P--SOSAADOX的腫瘤細(xì)胞毒性,明顯高于游離DOX及及SOSA/DOX,其作用機(jī)理主要與激活線粒體信號(hào)通路,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。MMF-7荷瘤裸鼠為動(dòng)物模型,體內(nèi)分布研究結(jié)果顯示,,TPP修飾可增強(qiáng)嫁接物膠束的腫瘤組織聚集。體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果顯示,C-P-CSOSA/DOX的抑瘤率為75.0%,顯著高于CSOSA/DOX的抑瘤率44.8%和游離DOX·HC1的抑瘤率55.0%。利用腫瘤細(xì)胞線粒體弱堿性pH內(nèi)環(huán)境的特點(diǎn),設(shè)計(jì)線粒體內(nèi)環(huán)境響應(yīng)釋放給藥系統(tǒng)。以弱酸性藥物雷公藤紅素(Celastrol,Cela)為模型藥物,透析法制備線粒體弱堿性敏感釋放給藥系統(tǒng)C-P-CSOSA/Cela。經(jīng)測(cè)定,C-P-CSOSA/Cela粒徑為63.5±18.0 nm,表面電位為22.1±0.3 mV。C-P-CSOSA/Cela在模擬線粒體弱堿性環(huán)境pH 8.0 PBS釋放介質(zhì)中呈現(xiàn)快速藥物釋放行為,12 h累積釋放百分率為80.7%,顯著高于C-P-CSOSA/Cela在模擬胞漿pH 7.4和溶酶體pH 5.0 PBS中12 h的藥物累積釋放百分率。經(jīng)測(cè)定,Cela在pH 8.0 PBS的溶解度為21.1±0.38 μg/mL,是pH 7.4 PBS溶解度的3.73倍。Cela 在pH 5.0 PBS 中不溶解。Cela在pH 8.0 PBS中較高的溶解度,促使疏水性Cela與膠束疏水內(nèi)核相互作用力減弱,促進(jìn)Cela從嫁接物膠束快速釋放。研究結(jié)果表明C-P-CSOSA/Cela可響應(yīng)線粒體弱堿性pH環(huán)境快速釋放Cela,提高線粒體內(nèi)Cela濃度,同時(shí)減少Cela在胞漿和溶酶體的泄漏。C-P-CSOSA/Cela與MCF細(xì)胞共孵育,線粒體明顯腫脹,嵴開始破裂退化,線粒體損傷較嚴(yán)重,顯示C-P-CSOSA/Cela具有促腫瘤細(xì)胞早期凋亡能力,明顯強(qiáng)于CSOSA/Cela和游離Cela。研究結(jié)果揭示,C-P-CSOSA/Cela可刺激ROS水平快速增加,引起線粒體膜電位降低,促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放至胞漿,誘導(dǎo)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。以MCF-7荷瘤裸鼠為動(dòng)物模型,研究結(jié)果證實(shí)C-P-CSOSA具有較好的腫瘤細(xì)胞線粒體靶向性,C-P-CSOSA/Cela的抑瘤率為80.2%,顯著高于CSOSA/Cela的抑瘤率58.4%和游離Cela的抑瘤率54.9%,通過響應(yīng)線粒體內(nèi)環(huán)境弱堿性pH的藥物敏感釋放,大幅度提高抗腫瘤療效,為腫瘤給藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)提供探索性新思路。采用外源性光熱刺激策略,設(shè)計(jì)線粒體靶向的藥物敏感釋放給藥系統(tǒng)。選擇近紅外(NIR)熒光探針親脂性陽離子IR780碘化物(IR780)修飾CSOSA嫁接物,DOX為模型藥物,透析法制備線粒體靶向的光熱敏感釋放給藥系統(tǒng)IR780-CSOSA/DOX。研究結(jié)果顯示,IR780-CSOSA嫁接物的IR780修飾比例為3.12%,該嫁接物在795 nm處有較強(qiáng)吸收,與IR780的吸收特性基本一致,表明IR780-CSOSA具備良好的近紅外吸收特性。光熱轉(zhuǎn)換能力研究結(jié)果顯示,IR780-CSOSA具有較好的光熱轉(zhuǎn)換效率,并通過減緩IR780降解來保持良好的光熱穩(wěn)定性。經(jīng)測(cè)定,IR780-CSOSA/DOX粒徑為119.0±7.6 nm,表面電位為37.8±0.9 mV。IR780-CSOSA/DOX在NIR激光照射下呈現(xiàn)快速藥物釋放行為,10 h累積釋放百分率為63.0%,48h累積釋放百分率為82.3%。研究發(fā)現(xiàn),光熱效應(yīng)產(chǎn)生的過高熱,可促使DOX溶解度明顯增加,削弱藥物與膠束內(nèi)核的相互作用力,導(dǎo)致IR780-CSOSA/DOX載藥納米粒結(jié)構(gòu)發(fā)生膨脹,粒徑增大,促進(jìn)DOX從膠束中快速釋放。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),IR780-CSOSA/DOX可選擇性聚集于腫瘤細(xì)胞線粒體,通過響應(yīng)NIR激光照射,誘導(dǎo)產(chǎn)生的過高熱觸發(fā)DOX在線粒體內(nèi)快速釋放,同時(shí),過高熱刺激線粒體,聯(lián)合誘導(dǎo)ROS水平大幅度提高,導(dǎo)致大量細(xì)胞色素C釋放至胞漿,誘導(dǎo)Caspase 9/3級(jí)聯(lián)反應(yīng),引起腫瘤細(xì)胞凋亡顯著性增加。IR780-CSOSA/DOX靶向分布到腫瘤組織后,經(jīng)NIR激光照射,腫瘤區(qū)域溫度快速升高,過高熱可促進(jìn)IR780-CSOSA/DOX更多地滲透到腫瘤深部。線粒體光熱敏感釋放給藥系統(tǒng)IR780-CSOSA/DOX抑瘤率為85.3%,顯著高于單獨(dú)化療組DOX·HCl的抑瘤率55.0%和單獨(dú)熱療組IR780-CSOSA的抑瘤率54.7%。研究結(jié)果揭示,IR780-CSOSA/DOX激光照射后腫瘤組織HSP70表達(dá)明顯上調(diào),證實(shí)熱效應(yīng)顯著;Cleaved Caspase 3及CD8表達(dá)水平顯著提高,表明腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡,釋放大量腫瘤抗原,可募集更多的CD8陽性T細(xì)胞到達(dá)腫瘤組織,激活機(jī)體免疫應(yīng)答;Ki67陽性細(xì)胞比例及CD31表達(dá)水平大幅度降低,表明腫瘤細(xì)胞增殖及血管生成受到明顯抑制。
【圖文】：

液調(diào)節(jié)至ｐＨ邋＝１０，攪拌下滴加０．１邋ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液進(jìn)行滴定溶液ｐＨ從１０到３的變化過程，實(shí)時(shí)記錄溶液ｐＨ值及的體積。以ＮａＯＨ水溶液（ｐＨ＝邋１０）為空白對(duì)照，測(cè)定Ｃ質(zhì)子緩沖能力。逡逑論逡逑脂酸糖脂嫁接物合成逡逑法制備低分子量殼聚糖，凝膠色譜法測(cè)定其分子量為２０邋ｙｔ選擇性斷裂殼聚糖Ｐ－（ｌ，邋４）－糖苷鍵［３８，３９１碳二亞胺作為硬脂酸分子結(jié)構(gòu)中的羧基，形成０－�；愲澹c殼聚水反應(yīng)，得兩親性殼聚糖硬脂酸嫁接物（ＣＳＯＳＡ），，化

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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R943

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