發(fā)布時(shí)間：2020-05-14 17:49

【摘要】：共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3相關(guān)激酶(Ataxia Telangiectasia and Rad3-related,ATR)是DNA損傷修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵激酶,不僅能夠在DNA損傷后激活細(xì)胞應(yīng)答阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程并穩(wěn)定復(fù)制叉,還能修復(fù)DNA,從而避免細(xì)胞凋亡。抑制ATR可以使腫瘤細(xì)胞中受損傷的DNA因得不到修復(fù)而凋亡,而正常細(xì)胞因存在多種DNA損傷修復(fù)機(jī)制且能相互補(bǔ)償而影響較小,因此ATR是理想的抗腫瘤靶點(diǎn)。目前,已報(bào)道的ATR抑制劑較少,可用資源有限。為開發(fā)高活性、高選擇性的新型的ATR抑制劑,為腫瘤的臨床治療提供更多的候選藥物選擇,本研究以ATR為靶點(diǎn),使用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù),設(shè)計(jì)、篩選并合成了兩個(gè)具有良好抗腫瘤活性的抑制劑。主要分為以下五部分:1.綜述本章總結(jié)了ATR及ATR抑制劑的抗腫瘤應(yīng)用,和常見的計(jì)算機(jī)藥物開發(fā)技術(shù)的研究進(jìn)展。首先介紹了ATR的結(jié)構(gòu)和功能及其在DNA損傷修復(fù)通路中的作用,和作為抗腫瘤靶點(diǎn)的有效性驗(yàn)證。其次回顧并總結(jié)了目前存在的ATR抑制劑及其在抗腫瘤的應(yīng)用,最后介紹了計(jì)算機(jī)藥物開發(fā)技術(shù)在抗腫瘤藥物開發(fā)中的研究進(jìn)展。為后續(xù)的研究提供了理論和技術(shù)支撐。2.基于藥效團(tuán)模型與分子片段法的ATR抑制劑的設(shè)計(jì)本章旨在通過藥效團(tuán)模型和分子片段法設(shè)計(jì)新型ATR抑制劑。首先通過已知的結(jié)構(gòu)多樣的28個(gè)ATR抑制劑構(gòu)建了5個(gè)配體藥效團(tuán)模型,根據(jù)300個(gè)已知的ATR抑制劑對(duì)藥效團(tuán)模型的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià),選出準(zhǔn)確率最高的藥效團(tuán)模型(LB-2)。其次根據(jù)LB-2模型提取140個(gè)ATR抑制劑(IC_(50)20nM)得到了42個(gè)藥效特征基團(tuán),并使用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其與ATR的相互作用進(jìn)一步評(píng)價(jià)后,最終得到29個(gè)與ATR抑制劑活性相關(guān)的藥效特征基團(tuán)。最后,以得到的藥效特征基團(tuán)和已知的70個(gè)ATR抑制劑(IC_(50)10nM)為基礎(chǔ),使用分子片段法設(shè)計(jì)得到125個(gè)全新的化合物。3.ATR抑制劑的評(píng)價(jià)本章通過構(gòu)建基于SVM的ATR抑制劑預(yù)測(cè)模型和分子對(duì)接模型對(duì)本研究設(shè)計(jì)的125個(gè)化合物成為ATR抑制劑的可能性進(jìn)行評(píng)價(jià),篩選有希望的化合物。首先從BindingDB數(shù)據(jù)庫(kù)和ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)里選取了700個(gè)化合物(包括400個(gè)陰性化合物和300個(gè)陽性化合物)作為訓(xùn)練集,188個(gè)化合物(包括100個(gè)陰性化合物和88個(gè)陽性化合物)作為測(cè)試集,并選擇94個(gè)與ATR抑制劑活性相關(guān)性較大的描述符用于化合物結(jié)構(gòu)表征。使用訓(xùn)練集對(duì)模型參數(shù)進(jìn)行考察后選取了7-Fold、c-SVC、RBF核函數(shù)為參數(shù)構(gòu)建了ATR抑制劑SVM預(yù)測(cè)模型(SVM-ATR),其SE為99%,SP為90.91%,ACC為95.21%,MCC為90.59%。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步使用網(wǎng)格搜索算法對(duì)SVM-ATR模型進(jìn)行優(yōu)化,確定模型參數(shù)c,g分別為1.4142,1.4142,交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)到95.5714%,最終優(yōu)化后預(yù)測(cè)模型(GS-SVM-ATR)的SE為100%,SP為90.91%,ACC為95.74%,MCC為89.76%。所設(shè)計(jì)的125個(gè)化合物經(jīng)GS-SVM-ATR模型評(píng)價(jià)后得到66個(gè)可能具有ATR抑制活性的化合物。最后通過參考化合物AZD6738(已進(jìn)入臨床試驗(yàn)研究的ATR抑制劑)與ATR蛋白的對(duì)接模型,進(jìn)一步評(píng)價(jià)66個(gè)化合物與ATR的結(jié)合,結(jié)果顯示化合物51、52與ATR能穩(wěn)定結(jié)合,且相互作用殘基與AZD6738對(duì)接模型基本一致。表明化合物51、52有望成為有效的ATR抑制劑。4.ATR抑制劑的合成本章旨在合成出化合物51、52,為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。首先通過逆合成分析確定了化合物51、52的合成路線。其次根據(jù)化合物51、52的合成路線,合成了化合物51、52。最后經(jīng)過氫譜、碳譜及質(zhì)譜分析,本研究合成的化合物51和52結(jié)構(gòu)正確,可用于后續(xù)研究。5.ATR抑制劑的抗腫瘤活性研究本章旨在研究化合物51、52的抗腫瘤活性及其可能的作用機(jī)制。以乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)為模型,通過化合物51、52單獨(dú)、以及與阿霉素聯(lián)合使用考察化合物51、52的抗腫瘤活性,并對(duì)可能的作用機(jī)制進(jìn)行推測(cè)。結(jié)果顯示化合物51、52對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC_(50)分別為496?M、451?M,有一定的抗腫瘤活性,但是抗腫瘤效果不明顯。但化合物51、52與阿霉素聯(lián)合使用時(shí)IC_(50)顯著低于阿霉素(30.368?M),分別為18.632?M和12?M,化合物51與阿霉素的協(xié)同作用CI=0.6511,為中度協(xié)同作用,化合物52與阿霉素的協(xié)同作用CI=0.4217,為高度協(xié)同作用。不同組合試驗(yàn)表明化合物51、52可能的抗腫瘤機(jī)制為通過抑制處于DNA損傷狀態(tài)的細(xì)胞的增殖而達(dá)到抗腫瘤的效果,與ATR抑制劑作用機(jī)制相吻合�；衔�51、52與阿霉素的最佳協(xié)同作用試驗(yàn)結(jié)果顯示,其最佳比例分別為3.5:1和3:1,抑制MCF-7細(xì)胞的IC_(50)分別為13?M和7?M,具有顯著優(yōu)于阿霉素的抗腫瘤效果。綜上所述,本研究通過構(gòu)建ATR抑制劑藥效團(tuán)模型、分子對(duì)接模型、SVM預(yù)測(cè)模型以及分子片段法設(shè)計(jì)、篩選并合成出兩個(gè)有望成為ATR抑制劑的新化合物,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其抗腫瘤活性,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步推測(cè)。本研究的結(jié)果將為新型ATR抑制劑的篩選以及其它小分子靶向藥物的開發(fā)提供方法借鑒,同時(shí),也有望為腫瘤的臨床治療提供新的選擇。
【圖文】：

藥物開發(fā)技術(shù)在抗腫瘤藥物開發(fā)中的應(yīng)用。為后續(xù)的研究提供了理論和技術(shù)支撐。1.1 ATR 及其生理功能1.1.1ATR 的結(jié)構(gòu)ATR 是磷脂酰肌醇 3-激酶相關(guān)激酶（Phosphatidylinositol3-Kinase RelatedKinase；PIKK）家族的成員，主要由三部分構(gòu)成，一共包含 2644 個(gè)氨基酸[1]（圖1.1）：第一部分是在 N-末端區(qū)域由 HEAT 重復(fù)組成的 ATRIP 相互作用域，是ATR 被激活的重要結(jié)構(gòu)域；第二部分是 FAT 結(jié)構(gòu)域，由在 PIKK 家族中高度保守的螺旋 HEAT 重復(fù)組成，為激酶結(jié)構(gòu)域提供結(jié)構(gòu)支持；第三部分是激酶結(jié)構(gòu)域，該激酶結(jié)構(gòu)域包括負(fù)責(zé) TOPBP1 和 FATC 結(jié)構(gòu)域結(jié)合的 PIKK 調(diào)控結(jié)構(gòu)域[2]。

ATR 抑制劑的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)與抗腫瘤活性研究被激活的途徑是復(fù)制蛋白 A（Repair Protein A ，RPA）快速結(jié)合單鏈 DNA（ssDNA），而 ATRIP（ATR-Interacting Protein）與 ATR 形成復(fù)合物后與 RPA包被的 ssDNA 結(jié)合，并將 ATR 募集到 DNA 損傷位點(diǎn)。Rad17 通過結(jié)合 RPA 包被的 ssDNA，，并反過來募集 9-1-1 復(fù)合物和 TopBP1，并刺激 ATR 蛋白激酶活性。ATR 還通過激活 Chk1（checkpoint kinase 1）來誘導(dǎo) S 和 G2/M 期的細(xì)胞周期停滯來促進(jìn) DNA 修復(fù)，以防止 DNA 損傷的細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂[8]。ATR 可以穩(wěn)定復(fù)制叉進(jìn)程防止 DNA 雙鏈斷裂，還有助于重新啟動(dòng)停滯的復(fù)制分支，ATR 的抑制或喪失會(huì)導(dǎo)致因無法解決停滯的復(fù)制叉、減慢復(fù)制叉進(jìn)展和 DNA 損傷積累，而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性或細(xì)胞死亡[9]。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96;TQ460.1;TQ015.9

【參考文獻(xiàn)】

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2 肖靜;房咪;陳姣;鄭珩;;藥效團(tuán)技術(shù)在抗感染新藥研究中的應(yīng)用[J];抗感染藥學(xué);2013年03期

3 朱偉;陳可冀;徐筱杰;;計(jì)算機(jī)藥物虛擬篩選技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用前景[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志;2007年03期

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