【摘要】：目的:通過長期孵育H_2O_2建立人白血病細(xì)胞K562耐藥模型,考察反應(yīng)氧族介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的機(jī)制。方法:使用熒光倒置顯微鏡觀察DCFH-DA染色后人白血病細(xì)胞K562和耐藥細(xì)胞K562/A02的細(xì)胞內(nèi)ROS(Reactive Oxygen Species)的分布和熒光強(qiáng)度,使用流式細(xì)胞儀檢測DCFH-DA染色后人白血病細(xì)胞K562和耐藥細(xì)胞K562/A02的細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。選用不同濃度的H_2O_2進(jìn)行造模時(shí)間和濃度篩選,采用MTT法測定阿霉素(Adriamycin,ADM)對(duì)模型K562細(xì)胞的抑制率,根據(jù)篩選結(jié)果選取H_2O_2的造模時(shí)間和濃度,以此建立的耐藥細(xì)胞模型命名為K562/ROS細(xì)胞。使用倒置顯微鏡觀察K562/ROS細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。采用MTT法測定各濃度紫杉醇(Taxol)、順鉑(Cisplatin,cDPP)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)、阿霉素和5-氟尿嘧啶(5-Flourouracil,5-FU)對(duì)K562/ROS細(xì)胞的抑制率,計(jì)算各抗腫瘤藥物的IC_(50)和模型細(xì)胞的耐藥指數(shù)(Resistant Index,RI)。使用PI單染法對(duì)K562、K562/ROS、K562/A02細(xì)胞染色,流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞的周期分布。使用DCFH-DA染色法對(duì)K562、K562/ROS、K562/A02細(xì)胞染色,流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化。使用Western blot法檢測三組細(xì)胞P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測K562、K562/ROS、K562/A02細(xì)胞對(duì)羅丹明123(Rhodamine,Rh123)的累積能力、反應(yīng)P-gp的活性;免疫染色后使用激光共聚焦顯微鏡觀察K562、K562/ROS、K562/A02細(xì)胞中P-gp和摻入的BrDU的定位與含量;另對(duì)K562,K562/ROS、K562/A02細(xì)胞孵育PI3K和NF-κB的抑制劑LY294002、BAY11-7082,MTT法檢測三組細(xì)胞對(duì)ADM耐藥性的變化;采用激光共聚焦顯微鏡檢測K562、K562/ROS、K562/A02細(xì)胞中耐藥、增殖相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和的表達(dá)與定位;Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)p-Akt、p-IκB、p-STAT3、P-gp的表達(dá),分析K562/ROS細(xì)胞耐藥產(chǎn)生的機(jī)制。結(jié)果:人白血病耐藥細(xì)胞K562/A02內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度高于敏感細(xì)胞K562,其含量約為敏感株細(xì)胞的2.46±0.34倍。經(jīng)條件篩選,0.1μmol/L的H_2O_2連續(xù)孵育12周建立的耐藥細(xì)胞模型命名為K562/ROS細(xì)胞。K562/ROS的細(xì)胞形態(tài)較敏感株發(fā)生較大的改變,由原來的圓形變?yōu)槎嗝�、不�?guī)則狀,細(xì)胞對(duì)瓶底的附著力增加,懸浮態(tài)減少,細(xì)胞呈團(tuán)片狀生長,細(xì)胞連接處模糊、增殖速度加快、代謝活性增加。K562/ROS細(xì)胞具有多藥耐藥性,對(duì)紫杉醇、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶的耐藥指數(shù)分別為292.82、3.35、4.41、52.65、1.73。與K562細(xì)胞相比,耐藥細(xì)胞K562/ROS的G_2/M期所占比例有顯著增加。ROS含量檢測結(jié)果表明:長期適量的H_2O_2孵育可升高K562細(xì)胞內(nèi)的基礎(chǔ)ROS的濃度水平。Western blot及激光共聚焦檢測結(jié)果表明:長期調(diào)控ROS可誘導(dǎo)K562細(xì)胞表達(dá)P-gp,增加的P-gp主要分布在細(xì)胞膜上。Rh123的累積實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,K562/ROS細(xì)胞上表達(dá)的P-gp具有較強(qiáng)的外排功能。通過機(jī)制研究發(fā)現(xiàn):PI3K和NF-κB的抑制劑可不同程度的逆轉(zhuǎn)K562/ROS細(xì)胞的耐藥性,其結(jié)果與K562/A02細(xì)胞情況相似。使用PI3K的抑制劑LY294002可降低p-Akt的表達(dá)、抑制NF-κB的入核、減少p-STAT3、P-gp的含量。使用NF-κB的抑制劑BAY11-7082可抑制NF-κB的入核、降低p-STAT3、P-gp的表達(dá),對(duì)p-Akt的含量無顯著影響。同時(shí)使用LY294002和BAY11-7082均可顯著下調(diào)K562/ROS細(xì)胞p-STAT3、P-gp的表達(dá),與對(duì)K562/A02細(xì)胞作用相似。結(jié)論:人白血病耐藥株ROS的基礎(chǔ)含量顯著高于其敏感株。通過對(duì)K562細(xì)胞長期定量孵育ROS可促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥,該耐藥細(xì)胞命名為K562/ROS。K562/ROS細(xì)胞主要特征表現(xiàn)為:細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加、細(xì)胞形態(tài)變化、外排蛋白功能與表達(dá)增強(qiáng)、細(xì)胞周期改變、細(xì)胞增殖加速。耐藥機(jī)制可能涉及過度激活的PI3K通路,通過誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)錄、激活STAT3通路,進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞上P-gp的功能與表達(dá),最終介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生。
【圖文】：

顯微鏡觀察下 K562 和 K562/A02 細(xì)胞內(nèi) ROS 的熒光強(qiáng)度及分布（200×代表性圖片。62 和 K562/A02 細(xì)胞內(nèi) ROS 含量的差異 K562/A02 細(xì)胞經(jīng)終濃度為 10μmol/L 的 DCFH-DA 染色后，，用 K562/A02 細(xì)胞內(nèi) ROS 的含量，如圖 1-2 所示，表明耐藥細(xì)胞細(xì)胞株內(nèi)的 ROS 含量，K562/A02 細(xì)胞內(nèi) ROS 含量約是 K。

圖 1-2 流式細(xì)胞儀檢測 K562 和 K562/A02 細(xì)胞內(nèi)的 ROS 含量，n=3,上圖為 3 次實(shí)驗(yàn)中代表性圖3.2 K562/ROS 耐藥模型的建立及其建立過程評(píng)價(jià)3.2.1 K562/ROS 耐藥細(xì)胞給藥濃度的篩選以用不同濃度的H2O2對(duì)人白血病細(xì)胞K562細(xì)胞進(jìn)行給藥濃度篩選，如圖1-3所濃度大于 10μmol/L 的 H2O2作用 2 天對(duì) K562 細(xì)胞的存活率有顯著抑制的作用。濃度1μmol/L~10μmol/L 的 H2O2作用 2 周對(duì) K562 細(xì)胞的存活率有顯著抑制作用、0.1μmol/L~1μmol/L 濃度的 H2O2作用 1 個(gè)月仍會(huì)導(dǎo)致 K562 細(xì)胞大量死亡，因此選用K562 細(xì)胞的存活率無影響的 0.1μmol/L 濃度的 H2O2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（篩選結(jié)果略）。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 文坤明;冷敏;程家平;陳正權(quán);陳奕霖;曾慶良;;姜黃素通過抑制STAT3通路調(diào)控人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株的耐藥性[J];中國免疫學(xué)雜志;2015年08期

2 王天曉;王穎瑩;張中慶;;STAT3小分子干擾RNA增強(qiáng)多柔比星的抗腫瘤活性[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2013年01期

3 葛紅雨;吳維光;韓建秋;王勇梅;;RNAi抑制HIF-1α基因逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國癌癥防治雜志;2010年01期

本文編號(hào)：2659773