【摘要】：潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是發(fā)生在盲腸及結(jié)直腸的慢性炎癥性疾病,可導(dǎo)致多種嚴重的腸道外炎癥表現(xiàn)和并發(fā)癥,甚至誘發(fā)結(jié)直腸癌,已成為全球性的公共健康威脅。目前,UC的一線治療藥物無法滿足臨床需要,迫切需要開發(fā)新的UC治療策略。益生菌降低腸道炎癥、增強腸道穩(wěn)態(tài)的功能得到越來越多的關(guān)注。目前雖然有益生菌治療結(jié)腸炎的報道,但是不同益生菌的作用效果差異明顯,而且需要更多的研究來剖析多菌種復(fù)合制劑的優(yōu)勢和作用機制,并指導(dǎo)益生菌的使用。另外,腸道微生物及其功能的相關(guān)認識的積累,正在改變對益生菌的理解和使用模式。傳統(tǒng)的益生菌種類有限,已經(jīng)明顯不能滿足對更多類型疾病治療的需求。開發(fā)哺乳動物腸道中的共生微生物資源,有助于發(fā)現(xiàn)新的有價值的微生物和藥物分子。在中醫(yī)上,發(fā)酵中藥六神曲(Massa Medicata Fermentata,MMF)和中草藥地錦草(Euphorbia humifusa Willd.)被用于治療胃腸道疾病。但是,關(guān)于MMF和地錦草對UC的治療潛力及其對腸道微生物影響的報道還很少,并且它們的副作用需要進一步明確。評估MMF和地錦草對腸道炎癥和損傷的治療效果和機制,對于開發(fā)潛在的UC治療藥物,明確中藥的適用范圍具有重要的意義。本研究旨在開發(fā)動物腸道共生微生物,發(fā)掘安全、高效的新型益生菌資源,并探究益生菌和中藥對UC的治療潛力和作用機制。本論文主要包括以下三部分的研究內(nèi)容:(1)松遼黑豬仔豬腸道微生物資源的開發(fā)與安全性分析。松遼黑豬是中國東北地區(qū)的地方豬種,其優(yōu)良的生長特性很大程度上得益于自身的腸道微生物,而目前對松遼黑豬腸道微生物的研究還非常少。為了篩選安全高效的新型益生菌,我們選取經(jīng)益生菌發(fā)酵的六神曲替代抗生素飼喂松遼黑豬仔豬,以此作為分離來源,利用五種培養(yǎng)基(改良M17培養(yǎng)基、M2GSC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、PTYG培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基),分離仔豬消化道不同部位的微生物。通過對比細菌菌落形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)和限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)結(jié)果,對分離菌株進行初步分類。然后通過溶血性分析,篩選得到不溶血的菌株;對這些菌株進行16S rRNA分子鑒定。最后,用藥敏紙片法分析了菌株對8種抗生素(氯霉素、鏈霉素、萬古霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐西林、卡那霉素和克林霉素)的敏感性。我們分離并保存了362株微生物,初步篩選出90株代表菌株進行了溶血性分析,有59株細菌表現(xiàn)為不溶血。細菌的16S rRNA分子鑒定結(jié)果顯示,分離菌株來自4個門12個屬,其中菌株BMJA-M17-12、BMJA-M17-32和BMJAM17-29與NCBI數(shù)據(jù)庫中親緣關(guān)系最近微生物的相似度分別為95.15%、95.81%和97.25%,表明有可能是新種微生物�？股孛舾行詫嶒灲Y(jié)果顯示,除BMXAM17-3(比對結(jié)果為Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)對2種抗生素敏感外,其他菌株對至少5種抗生素敏感。分離的益生菌菌株Lactobacillus reuteri RAM0101,Bacillus coagulans RAM1202和Clostridium butyricum RAM0216對8種抗生素全部敏感。(2)益生菌和中藥對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥和損傷的緩解作用研究。利用DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型,以臨床上治療UC的藥物柳氮磺胺吡啶(SASP)作為陽性對照,評估復(fù)合益生菌劑(L.reuteri RAM0101,B.coagulans RAM1202,Bifidobacterium longum CICC6197和C.butyricum RAM0216)、中藥MMF和地錦草治療UC的潛力。我們對比了四種干預(yù)對模型小鼠疾病表現(xiàn)(體重丟失、腹瀉、便血、死亡率)的治療作用。利用HE染色評估了結(jié)腸組織病理學(xué)損傷和炎性細胞浸潤情況,通過RT-qPCR和Western blot分析了對結(jié)腸黏膜炎癥因子水平和腸道屏障功能的影響,并利用Illumina Hiseq測序平臺分析了藥物對結(jié)腸黏膜微生態(tài)修復(fù)的作用。結(jié)果表明,SASP降低了結(jié)腸炎性細胞浸潤和促炎性細胞因子TNF-α,IL-6和IL-1β的mRNA水平,但不能緩解緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的降低;MMF對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎沒有治療效果;地錦草緩解了結(jié)腸炎小鼠的疾病活動指數(shù)(DAI)和結(jié)腸組織病理學(xué)損傷,并降低了小鼠的死亡率和結(jié)腸黏膜中促炎性細胞因子的mRNA水平,但增加了結(jié)腸黏膜中促炎性微生物Proteobacteria和Cyanobacteria的比例;四株益生菌的組合顯著緩解了結(jié)腸炎小鼠的疾病表現(xiàn),降低了結(jié)腸組織病理學(xué)損傷和促炎性細胞因子TNF-α,IL-6和IL-1β的mRNA水平,緩解了緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的降低。益生菌復(fù)合物還恢復(fù)了結(jié)腸黏膜中核心微生物群的相對豐度,降低了促炎性細菌的比例,并增加了有益細菌Bifidobacterium和Blautia的比例。以上研究結(jié)果表明,四株益生菌的組合比臨床抗炎藥物SASP和中藥地錦草和六神曲更有利于修復(fù)腸道微生態(tài)和屏障功能的損傷,并有效降低腸道炎癥,增強腸道穩(wěn)態(tài)。(3)復(fù)合益生菌改善宿主腸道炎癥和損傷的機制研究。我們進一步對比了單一菌株和四株益生菌的復(fù)合物對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的治療效果,旨在探究復(fù)合益生菌劑緩解結(jié)腸炎的作用機制,并明確單一菌株與復(fù)合益生菌治療效果的差異。利用RT-qPCR和Western blot分析了結(jié)腸黏膜炎癥因子水平和腸道屏障功能相關(guān)蛋白質(zhì)的水平;使用基于Pacbio Sequel測序平臺的全長16S rRNA測序,分析了結(jié)腸黏膜的微生物組成。結(jié)果顯示四株益生菌對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的治療效果不同,C.butyricum RAM0216和B.coagulans RAM1202比L.reuteri RAM0101和B.longum CICC6197的保護作用更強;這四株益生菌分別調(diào)節(jié)了不同的結(jié)腸黏膜細胞因子和屏障功能相關(guān)基因的mRNA水平;四株益生菌的組合表現(xiàn)出了菌株之間的協(xié)同作用,顯著地降低了促炎性細胞因子以及IL-22和Reg3γ的mRNA水平,并增加了MUC-2,Occludin,Claudin-1和抗炎細胞因子IL-10的mRNA水平;復(fù)合益生菌比單一益生菌更顯著地降低了結(jié)腸黏膜中促炎性細菌Cyanobacteria和Proteobacteria的相對豐度,增加了抗炎細菌Akkermansia,Blautia和Lactobacillus的相對豐度。以上結(jié)果表明,四株益生菌調(diào)節(jié)了不同的腸道免疫應(yīng)答通路和屏障功能。四株不同功能的益生菌的復(fù)合比單一益生菌更有效地降低了腸道屏障的損傷和抗原的入侵,并修復(fù)了結(jié)腸黏膜微生物生態(tài)。綜上所述,本研究利用多種培養(yǎng)條件,從益生菌發(fā)酵的六神曲替代抗生素飼喂的松遼黑豬仔豬的消化道中分離腸道共生微生物,篩選出不溶血,而且對抗生素敏感的潛在益生菌。動物實驗結(jié)果表明,不同的益生菌菌株調(diào)節(jié)了不同的腸道免疫應(yīng)答途徑和屏障功能。不同功能的益生菌的組合比抗炎藥物SASP和中藥地錦草更有效地修復(fù)結(jié)腸黏膜微生態(tài),恢復(fù)腸道微生物與免疫生態(tài)位之間相互作用的平衡,增加結(jié)腸黏膜屏障功能和IL-10的水平,進而緩解腸道炎癥和損傷。
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文.2.3.5 分離菌株的溶血性分析按照 2.2.1.1 配制哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，將分離純化的菌株劃線于哥倫血瓊脂平板。37°C 厭氧培養(yǎng) 18 24h，觀察菌落形態(tài)。α-溶血表現(xiàn)為狹小的綠色溶血環(huán)；β-溶血表現(xiàn)為寬大的、界限分明的、完全透明的溶血環(huán)[101]；γ為不溶血，即不出現(xiàn)溶血環(huán)。分離自臨床患者糞便的 Aerococcusspp.RAM03為 α-溶血陽性對照菌株（圖 2.1A），StreptococcuspyogenesCICC10373 作為血陽性對照菌株（圖 2.1 B）。

部分分離菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李永正;;基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的航班延誤DSS研究[J];吉林廣播電視大學(xué)學(xué)報;2017年09期

2 余貽漢;楊建美;趙莉;徐沙;汪毅;;中藥制劑聯(lián)合美沙拉嗪對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的治療作用[J];實用藥物與臨床;2015年06期

3 張煒;郭韶升;;DSS中用電子表格進行貝葉斯決策[J];機械管理開發(fā);2007年06期

4 吳鐵洲;陳學(xué)廣;梁京章;王志武;;網(wǎng)格服務(wù)環(huán)境下DSS的構(gòu)建[J];電子科技大學(xué)學(xué)報;2007年S3期

5 顧紅艷;;從DSS的發(fā)展重新認識決策支持系統(tǒng)[J];沈陽工程學(xué)院學(xué)報(社會科學(xué)版);2006年03期

6 張秀玉;;基于數(shù)據(jù)倉庫在DSS中的應(yīng)用研究[J];寧德師專學(xué)報(自然科學(xué)版);2005年04期

7 梁雯,梁厚蘊;主動數(shù)據(jù)庫及在DSS中的應(yīng)用研究[J];微機發(fā)展;2004年08期

8 馮書興,陳浩光,秦大國;衛(wèi)星系統(tǒng)作戰(zhàn)效能評估輔助DSS研究[J];計算機工程與設(shè)計;2003年10期

9 徐琪,徐福緣;車間調(diào)度DSS設(shè)計的優(yōu)化方法[J];計算機工程與應(yīng)用;2002年04期

10 朱世朋,張全壽;DSS的建設(shè)和業(yè)務(wù)流程重組[J];管理工程學(xué)報;2001年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉復(fù)巖;呂韶義;;決策表在DSS中的應(yīng)用[A];計算機模擬與信息技術(shù)會議論文集[C];2001年

2 鄧貴仕;;新一代決策支持系統(tǒng)(DSS)的開發(fā)[A];系統(tǒng)工程與可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略——中國系統(tǒng)工程學(xué)會第十屆年會論文集[C];1998年

3 魏芳娣;胡笑旋;;電子商務(wù)環(huán)境下的DSS應(yīng)用模式及資源描述[A];第十屆中國管理科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

4 朱大為;王剛;張婷;宋倩;;衛(wèi)星導(dǎo)航定位系統(tǒng)DSS體制干擾影響分析[A];第三屆中國衛(wèi)星導(dǎo)航學(xué)術(shù)年會電子文集——S01北斗/GNSS導(dǎo)航應(yīng)用[C];2012年

5 余琳;鄧玲;;常見聚類算法的比較以及DSS系統(tǒng)中的應(yīng)用[A];湖北省通信學(xué)會、武漢通信學(xué)會2009年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2009年

6 栗斌;劉紀平;王亮;石麗紅;;基于GIS和DSS的電子政務(wù)空間輔助決策系統(tǒng)分析和應(yīng)用[A];中國地理信息系統(tǒng)協(xié)會第九屆年會論文集[C];2005年

7 石磊;韓亞飛;劉佳麗;孫中美;原文靜;丁龐華;郭一;賈博宜;寇富舜;李軍祥;;清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠氧化應(yīng)激的作用影響[A];第三十屆全國中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2018年

8 聶明濤;張慕剛;劉進寶;翟金浩;伯江波;;DSS數(shù)字化地震隊在復(fù)雜城區(qū)地震采集項目中的應(yīng)用[A];中國石油學(xué)會2017年物探技術(shù)研討會論文集[C];2017年

9 鐘登華;張偉波;夏黎明;;基于DSS的施工系統(tǒng)仿真研究~1[A];全國青年管理科學(xué)與系統(tǒng)科學(xué)論文集第5卷[C];1999年

10 李靖;朱毅;董志;陳恩斌;黃凌;趙錦;;水黃皮根總黃酮對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用[A];海南省藥學(xué)會2007年論文匯編[C];2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王彥博;功能各異的益生菌復(fù)合緩解DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎機制研究[D];吉林大學(xué);2019年

2 張勝忠;水稻花器官發(fā)育基因OsARF19和粒型基因DSS的分子鑒定和功能分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 王旭丹;四神丸治療DSS誘導(dǎo)的小鼠實驗性結(jié)腸炎免疫機制的研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

4 周明;基于數(shù)據(jù)挖掘的制造業(yè)采購DSS理論及方法研究[D];天津大學(xué);2009年

5 李釗;海洋工程裝備項目進度監(jiān)控模式及預(yù)警DSS總體設(shè)計[D];哈爾濱工程大學(xué);2011年

6 杜超;氯化釓抑制結(jié)腸粘膜炎癥改善TNBS和DSS誘導(dǎo)的腸炎[D];山東大學(xué);2014年

7 馬剛;采用數(shù)據(jù)倉庫技術(shù)實現(xiàn)貸款管理DSS[D];大連理工大學(xué);2000年

8 朱超慧;中和IL-17及受體對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的作用[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2016年

9 焦麗;iPLA_2β對于ConA和DSS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷和腸損傷的保護作用及其機制的研究[D];吉林大學(xué);2016年

10 王偉強;IL-37b基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對DSS誘導(dǎo)的腸炎緩解作用的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 褚旭芳;蘆丁在DSS誘導(dǎo)的急性實驗性結(jié)腸炎中的作用及機制研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

2 王昕旭;沙棘多糖對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎調(diào)控機制研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

3 趙閃閃;IL-22對DSS誘導(dǎo)的慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸粘膜occludin的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

4 田春雨;乳酸桿菌對DSS-誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的抑制作用[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2018年

5 繆欣;miR-15a/16~(-/-)小鼠CD8~+T細胞的生物學(xué)功能及其對DSS-腸炎發(fā)病的影響[D];揚州大學(xué);2018年

6 何雙艷;姜黃素對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用的實驗研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2013年

7 沈偉;基于知識工程的區(qū)域規(guī)劃DSS關(guān)鍵技術(shù)研究[D];武漢工程大學(xué);2011年

8 何紹民;基于數(shù)據(jù)倉庫的石油企業(yè)DSS設(shè)計研究[D];西南石油學(xué)院;2004年

9 郭琳;姜黃素對DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制的研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

10 牛亦;基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的航班延誤DSS研究[D];電子科技大學(xué);2010年

，

本文編號：2659721