【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)特異性感染肝細(xì)胞,引起急性感染和慢性感染,其中慢性感染是肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要原因。現(xiàn)有治療慢性乙肝的臨床藥物中,長(zhǎng)期使用核苷類似物容易導(dǎo)致耐藥,存在停藥反彈,而干擾素治療應(yīng)答較低,因此尋找新的抗乙肝藥物是亟待解決的問(wèn)題。從病毒-宿主角度出發(fā),尋找直接的抗病毒藥物和基于宿主因子作為靶點(diǎn)有助于豐富抗乙肝藥物的研發(fā)策略。SAMHD1(Sterile alpha motif(SAM)and histidine/aspartic acid(HD)domain-containing protein 1)是一種肝細(xì)胞內(nèi)重要的宿主限制性因子,能夠通過(guò)其脫氧核苷三磷酸水解酶(dNTPase)活性抑制多種病毒復(fù)制。最近研究發(fā)現(xiàn),在HIV-1感染的增殖細(xì)胞中,SAMHD1蛋白的T592位點(diǎn)的磷酸化受細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)的調(diào)控。磷酸化的SAMHD1喪失了其抗病毒作用。但是在HBV感染中,哪種CDK激酶主要參與調(diào)控SAMHD1的磷酸化和抗病毒作用尚不清楚,同時(shí),CDK激酶抑制劑是否能通過(guò)抑制SAMHD1的磷酸化,從而作為抗乙肝的藥物尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本文主要鑒定了HBV感染的肝細(xì)胞中,細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2參與調(diào)控了SAMHD1磷酸化和病毒的復(fù)制,進(jìn)一步從現(xiàn)有的多種CDK2激酶抑制劑中篩選出有效抑制SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的CDK2激酶抑制劑。我們的研究結(jié)果表明:在肝細(xì)胞中,CDK2與SAMHD1共定位于細(xì)胞核內(nèi),二者可以相互作用,CDK2能夠調(diào)控SAMHD1的磷酸化和HBV的復(fù)制;另一方面,對(duì)現(xiàn)有靶向CDK2激酶的抑制劑進(jìn)行抗病毒功能篩選:我們鑒定并篩選出CDK2 inhibitor II和CDK2 inhibitor III能夠通過(guò)抑制SAMHD1磷酸化發(fā)揮抗HBV作用。研究結(jié)果有助于闡明HBV感染宿主肝細(xì)胞后,CDK2激酶磷酸化宿主限制性因子SAMHD1,限制其抗病毒的機(jī)制,并以CDK2激酶為靶點(diǎn)篩選出了兩種抑制HBV復(fù)制的化合物(CDK2 inhibitor II和CDK2 inhibitor III),為探索HBV的臨床治療藥物提供了新的方向。方法:研究分為兩部分。第一部分:鑒定出CDK2激酶參與調(diào)控SAMHD1磷酸化。(1)在Huh7.0細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)的SAMHD1和CDK1或CDK2,通過(guò)Co-IP(Co-Immunoprecipitation)探究在Huh7.0細(xì)胞中,SAMHD1與CDK1或CDK2的相互作用;(2)通過(guò)免疫熒光研究了SAMHD1和CDK2在Huh7.0細(xì)胞中的定位;(3)在Huh7.0細(xì)胞中通過(guò)siRNA分別干擾CDK1和CDK2的表達(dá),分別提取細(xì)胞總蛋白,病毒核心顆粒及HBV表面抗原,通過(guò)Western blot,Southern blot,qPCR及ELISA檢測(cè)siCDK1和siCDK2對(duì)SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的影響。第二部分:抑制HBV復(fù)制的CDK2激酶抑制劑的篩選和鑒定:(1)通過(guò)MTT法檢測(cè)了現(xiàn)有的13種CDK2抑制劑對(duì)細(xì)胞毒性的影響:將靶向CDK2的特異性抑制劑作用于HBV穩(wěn)定復(fù)制的細(xì)胞HepAD38,通過(guò)MTT法檢測(cè)CDK2抑制劑對(duì)細(xì)胞毒性的影響,篩選出細(xì)胞毒性較小的4種CDK2激酶抑制劑;(2)在HepAD38細(xì)胞上研究CDK2抑制劑對(duì)SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的影響:CDK2抑制劑作用于過(guò)表達(dá)SAMHD1的HepAD38細(xì)胞中后,提取細(xì)胞總蛋白,病毒核心顆粒及總RNA,用qPCR檢測(cè)CDK2抑制劑對(duì)HBV復(fù)制的影響,Western blot檢測(cè)其對(duì)SAMHD1磷酸化水平的影響;(3)在Huh7.0細(xì)胞研究CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ對(duì)細(xì)胞周期、SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的影響:將CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ作用于過(guò)表達(dá)SAMHD1的Huh7.0細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化;分別提取細(xì)胞總蛋白和病毒核心顆粒,Western blot檢測(cè)CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ對(duì)SAMHD1磷酸化水平的影響,qPCR檢測(cè)其對(duì)HBV復(fù)制的影響;(4)進(jìn)一步利用siRNA干擾SAMHD1的表達(dá),檢測(cè)CDK2激酶抑制劑對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用是否依賴于宿主限制性因子SAMHD1的磷酸化。結(jié)果:第一部分,我們鑒定了在HBV感染肝細(xì)胞中,CDK2激酶參與調(diào)控了SAMHD1的磷酸化:(1)通過(guò)Co-IP試驗(yàn)研究了SAMHD1與CDK2在Huh7.0細(xì)胞中存在相互作用;(2)通過(guò)免疫熒光檢測(cè)了SAMHD1和CDK2在Huh7.0中均定位在細(xì)胞核內(nèi);(3)干擾CDK1或CDK2后,Southern blot及qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾CDK2可以抑制HBV DNA的復(fù)制,而干擾CDK1對(duì)HBV的復(fù)制沒(méi)有明顯作用;通過(guò)ELISA顯示干擾CDK1或CDK2的表達(dá)對(duì)HBV表面抗原水平無(wú)明顯影響;Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),干擾CDK2表達(dá)后,SAMHD1的磷酸化水平明顯下降,而干擾CDK1的表達(dá)后,SAMHD1的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中,CDK2激酶和SAMHD1蛋白存在相互作用,且二者共定位于細(xì)胞核中;進(jìn)一步利用RNA干擾,鑒定出在肝細(xì)胞中CDK2激酶參與調(diào)控SAMHD1的磷酸化和HBV的復(fù)制。第二部分:抑制HBV復(fù)制的CDK2激酶抑制劑的篩選和鑒定:(1)在現(xiàn)有的13種CDK2激酶抑制劑中,通過(guò)MTT法首先篩選出4種細(xì)胞毒性相對(duì)較小的CDK2抑制劑;(2)在HBV穩(wěn)定復(fù)制的細(xì)胞系HepAD38細(xì)胞上篩選出兩種顯著抑制病毒復(fù)制和SAMHD1磷酸化的CDK2抑制劑:將上述4種CDK2激酶抑制劑作用于過(guò)表達(dá)SAMHD1的HepAD38細(xì)胞中后,提取病毒核心顆粒,通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CDK2inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ在5μM的濃度顯著抑制HBV復(fù)制,通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨著CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ藥物濃度的增加,SAMHD1的磷酸化水平逐漸減弱。此外,通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ對(duì)病毒的RNA水平無(wú)明顯作用。結(jié)果表明CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ可以降低SAMHD1的磷酸化和抑制HBV的復(fù)制,這種抗病毒作用主要發(fā)生在病毒DNA的復(fù)制環(huán)節(jié);(3)在Huh7.0細(xì)胞上驗(yàn)證CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ對(duì)SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的調(diào)控:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),加入CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ后,細(xì)胞停滯在G0/G1期,提取病毒核心顆粒,qPCR檢測(cè)結(jié)果表明,隨著CDK2inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ濃度的增加,病毒復(fù)制水平逐漸降低。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨著CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ濃度的增加,SAMHD1的磷酸化水平逐漸減弱;進(jìn)一步干擾內(nèi)源性SAMHD1表達(dá)后,CDK2抑制劑抑制HBV的作用消失,表明CDK2抑制劑抗HBV復(fù)制依賴于SAMHD1的磷酸化。結(jié)論:在HBV感染的肝細(xì)胞中,CDK2激酶參與了宿主限制性因子SAMHD1的磷酸化和病毒復(fù)制的調(diào)控;CDK2激酶可以與宿主限制性因子SAMHD1直接發(fā)生相互作用,二者共定位于細(xì)胞核;我們篩選出CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ,能夠在肝細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控SAMHD1的磷酸化而發(fā)揮抗病毒作用。
【圖文】：

圖 2.1 SAMHD1 與 CDK2 的相互作用Fig 2.1 Interaction between SAMHD1 and CDK2MHD1 的細(xì)胞共定位確 CDK2 及 SAMHD1 在肝細(xì)胞中的定位， HepAD38 細(xì)胞中的定位：結(jié)果顯示 SAMH說(shuō)明 CDK2 與 SAMHD1 的相互作用發(fā)生在

圖 2.1 SAMHD1 與 CDK2 的相互作用Fig 2.1 Interaction between SAMHD1 and CDK2 和 SAMHD1 的細(xì)胞共定位一步明確 CDK2 及 SAMHD1 在肝細(xì)胞中的定位，我們通D1 在 HepAD38 細(xì)胞中的定位：結(jié)果顯示 SAMHD1 和 C。由此說(shuō)明 CDK2 與 SAMHD1 的相互作用發(fā)生在細(xì)胞核
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R512.62;R978.7

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本文編號(hào)：2658690