【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)特異性感染肝細(xì)胞,引起急性感染和慢性感染,其中慢性感染是肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要原因。現(xiàn)有治療慢性乙肝的臨床藥物中,長期使用核苷類似物容易導(dǎo)致耐藥,存在停藥反彈,而干擾素治療應(yīng)答較低,因此尋找新的抗乙肝藥物是亟待解決的問題。從病毒-宿主角度出發(fā),尋找直接的抗病毒藥物和基于宿主因子作為靶點有助于豐富抗乙肝藥物的研發(fā)策略。SAMHD1(Sterile alpha motif(SAM)and histidine/aspartic acid(HD)domain-containing protein 1)是一種肝細(xì)胞內(nèi)重要的宿主限制性因子,能夠通過其脫氧核苷三磷酸水解酶(dNTPase)活性抑制多種病毒復(fù)制。最近研究發(fā)現(xiàn),在HIV-1感染的增殖細(xì)胞中,SAMHD1蛋白的T592位點的磷酸化受細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)的調(diào)控。磷酸化的SAMHD1喪失了其抗病毒作用。但是在HBV感染中,哪種CDK激酶主要參與調(diào)控SAMHD1的磷酸化和抗病毒作用尚不清楚,同時,CDK激酶抑制劑是否能通過抑制SAMHD1的磷酸化,從而作為抗乙肝的藥物尚未見報道。因此本文主要鑒定了HBV感染的肝細(xì)胞中,細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2參與調(diào)控了SAMHD1磷酸化和病毒的復(fù)制,進(jìn)一步從現(xiàn)有的多種CDK2激酶抑制劑中篩選出有效抑制SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的CDK2激酶抑制劑。我們的研究結(jié)果表明:在肝細(xì)胞中,CDK2與SAMHD1共定位于細(xì)胞核內(nèi),二者可以相互作用,CDK2能夠調(diào)控SAMHD1的磷酸化和HBV的復(fù)制;另一方面,對現(xiàn)有靶向CDK2激酶的抑制劑進(jìn)行抗病毒功能篩選:我們鑒定并篩選出CDK2 inhibitor II和CDK2 inhibitor III能夠通過抑制SAMHD1磷酸化發(fā)揮抗HBV作用。研究結(jié)果有助于闡明HBV感染宿主肝細(xì)胞后,CDK2激酶磷酸化宿主限制性因子SAMHD1,限制其抗病毒的機(jī)制,并以CDK2激酶為靶點篩選出了兩種抑制HBV復(fù)制的化合物(CDK2 inhibitor II和CDK2 inhibitor III),為探索HBV的臨床治療藥物提供了新的方向。方法:研究分為兩部分。第一部分:鑒定出CDK2激酶參與調(diào)控SAMHD1磷酸化。(1)在Huh7.0細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)的SAMHD1和CDK1或CDK2,通過Co-IP(Co-Immunoprecipitation)探究在Huh7.0細(xì)胞中,SAMHD1與CDK1或CDK2的相互作用;(2)通過免疫熒光研究了SAMHD1和CDK2在Huh7.0細(xì)胞中的定位;(3)在Huh7.0細(xì)胞中通過siRNA分別干擾CDK1和CDK2的表達(dá),分別提取細(xì)胞總蛋白,病毒核心顆粒及HBV表面抗原,通過Western blot,Southern blot,qPCR及ELISA檢測siCDK1和siCDK2對SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的影響。第二部分:抑制HBV復(fù)制的CDK2激酶抑制劑的篩選和鑒定:(1)通過MTT法檢測了現(xiàn)有的13種CDK2抑制劑對細(xì)胞毒性的影響:將靶向CDK2的特異性抑制劑作用于HBV穩(wěn)定復(fù)制的細(xì)胞HepAD38,通過MTT法檢測CDK2抑制劑對細(xì)胞毒性的影響,篩選出細(xì)胞毒性較小的4種CDK2激酶抑制劑;(2)在HepAD38細(xì)胞上研究CDK2抑制劑對SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的影響:CDK2抑制劑作用于過表達(dá)SAMHD1的HepAD38細(xì)胞中后,提取細(xì)胞總蛋白,病毒核心顆粒及總RNA,用qPCR檢測CDK2抑制劑對HBV復(fù)制的影響,Western blot檢測其對SAMHD1磷酸化水平的影響;(3)在Huh7.0細(xì)胞研究CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ對細(xì)胞周期、SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的影響:將CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ作用于過表達(dá)SAMHD1的Huh7.0細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化;分別提取細(xì)胞總蛋白和病毒核心顆粒,Western blot檢測CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ對SAMHD1磷酸化水平的影響,qPCR檢測其對HBV復(fù)制的影響;(4)進(jìn)一步利用siRNA干擾SAMHD1的表達(dá),檢測CDK2激酶抑制劑對HBV復(fù)制的抑制作用是否依賴于宿主限制性因子SAMHD1的磷酸化。結(jié)果:第一部分,我們鑒定了在HBV感染肝細(xì)胞中,CDK2激酶參與調(diào)控了SAMHD1的磷酸化:(1)通過Co-IP試驗研究了SAMHD1與CDK2在Huh7.0細(xì)胞中存在相互作用;(2)通過免疫熒光檢測了SAMHD1和CDK2在Huh7.0中均定位在細(xì)胞核內(nèi);(3)干擾CDK1或CDK2后,Southern blot及qPCR檢測發(fā)現(xiàn)干擾CDK2可以抑制HBV DNA的復(fù)制,而干擾CDK1對HBV的復(fù)制沒有明顯作用;通過ELISA顯示干擾CDK1或CDK2的表達(dá)對HBV表面抗原水平無明顯影響;Western blot檢測發(fā)現(xiàn),干擾CDK2表達(dá)后,SAMHD1的磷酸化水平明顯下降,而干擾CDK1的表達(dá)后,SAMHD1的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞中,CDK2激酶和SAMHD1蛋白存在相互作用,且二者共定位于細(xì)胞核中;進(jìn)一步利用RNA干擾,鑒定出在肝細(xì)胞中CDK2激酶參與調(diào)控SAMHD1的磷酸化和HBV的復(fù)制。第二部分:抑制HBV復(fù)制的CDK2激酶抑制劑的篩選和鑒定:(1)在現(xiàn)有的13種CDK2激酶抑制劑中,通過MTT法首先篩選出4種細(xì)胞毒性相對較小的CDK2抑制劑;(2)在HBV穩(wěn)定復(fù)制的細(xì)胞系HepAD38細(xì)胞上篩選出兩種顯著抑制病毒復(fù)制和SAMHD1磷酸化的CDK2抑制劑:將上述4種CDK2激酶抑制劑作用于過表達(dá)SAMHD1的HepAD38細(xì)胞中后,提取病毒核心顆粒,通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)CDK2inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ在5μM的濃度顯著抑制HBV復(fù)制,通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn),隨著CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ藥物濃度的增加,SAMHD1的磷酸化水平逐漸減弱。此外,通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ對病毒的RNA水平無明顯作用。結(jié)果表明CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ可以降低SAMHD1的磷酸化和抑制HBV的復(fù)制,這種抗病毒作用主要發(fā)生在病毒DNA的復(fù)制環(huán)節(jié);(3)在Huh7.0細(xì)胞上驗證CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ對SAMHD1磷酸化和病毒復(fù)制的調(diào)控:流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),加入CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ后,細(xì)胞停滯在G0/G1期,提取病毒核心顆粒,qPCR檢測結(jié)果表明,隨著CDK2inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ濃度的增加,病毒復(fù)制水平逐漸降低。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),隨著CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ濃度的增加,SAMHD1的磷酸化水平逐漸減弱;進(jìn)一步干擾內(nèi)源性SAMHD1表達(dá)后,CDK2抑制劑抑制HBV的作用消失,表明CDK2抑制劑抗HBV復(fù)制依賴于SAMHD1的磷酸化。結(jié)論:在HBV感染的肝細(xì)胞中,CDK2激酶參與了宿主限制性因子SAMHD1的磷酸化和病毒復(fù)制的調(diào)控;CDK2激酶可以與宿主限制性因子SAMHD1直接發(fā)生相互作用,二者共定位于細(xì)胞核;我們篩選出CDK2 inhibitorⅡ和CDK2 inhibitorⅢ,能夠在肝細(xì)胞中通過調(diào)控SAMHD1的磷酸化而發(fā)揮抗病毒作用。
【圖文】：

圖 2.1 SAMHD1 與 CDK2 的相互作用Fig 2.1 Interaction between SAMHD1 and CDK2MHD1 的細(xì)胞共定位確 CDK2 及 SAMHD1 在肝細(xì)胞中的定位， HepAD38 細(xì)胞中的定位：結(jié)果顯示 SAMH說明 CDK2 與 SAMHD1 的相互作用發(fā)生在

圖 2.1 SAMHD1 與 CDK2 的相互作用Fig 2.1 Interaction between SAMHD1 and CDK2 和 SAMHD1 的細(xì)胞共定位一步明確 CDK2 及 SAMHD1 在肝細(xì)胞中的定位，我們通D1 在 HepAD38 細(xì)胞中的定位：結(jié)果顯示 SAMHD1 和 C。由此說明 CDK2 與 SAMHD1 的相互作用發(fā)生在細(xì)胞核
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R512.62;R978.7

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本文編號：2658690