【摘要】：利巴韋林是具有廣譜抗病毒的核苷類藥物,因其具有高療效、低毒性、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于多種病毒疾病治療中。酶法合成是利用嘌呤核苷磷酸化酶催化嘌吟核苷與TCA反應(yīng)生成利巴韋林,具有巨大的工業(yè)前景。論文首先對(duì)可表達(dá)PNPase的乙酰短桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,并確定了最佳蛋白胨來源,同時(shí)利用響應(yīng)面法在保證轉(zhuǎn)化率的前提下將菌濃提高到16.8 g/L,提高了25.4%,同時(shí)價(jià)格降低了28.3%。將三條分別來源于枯草芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌和乙酰短桿菌的基因序列與pET20b載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,并在E.coli BL21(DE3)中高效表達(dá)得到酶BsPNP、BhPNP和BaPNP。通過對(duì)三個(gè)重組菌的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,使目的蛋白表達(dá)都占總蛋白的50%以上。利用鎳柱親和層析一步純化目的蛋白,通過SDS-PAGE檢測(cè)確認(rèn)得到純酶。通過對(duì)三個(gè)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究,確定上述三個(gè)蛋白酶的最適作用溫度分別是65 ℃,75 ℃和65 ℃,最適作用pH分別是7.3,7.0和8.0,并確定它們?cè)趐H6.0-11.0條件下都具有良好的pH穩(wěn)定性,溫度穩(wěn)定性趨勢(shì)也基本一致,其中BhPNP穩(wěn)定性最佳,在65℃下孵育1 h后酶活力仍有90%,通過測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)BhPNP的催化能力最高。利用乙酰短桿菌和重組菌合成利巴韋林,通過對(duì)比,發(fā)現(xiàn)重組菌的轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙酰短桿菌。通過優(yōu)化合成工藝,將反應(yīng)時(shí)間由10 h縮短為2h,菌體添加量降低了10倍,底物濃度由100 mmol/L提高到400 mmol/L。
【圖文】：

用某種產(chǎn)核苷磷酸化酶的微生物作為酶源，在該酶源的作用下核苷類化共同反應(yīng)生成ＲＢＶ。卩票呤核苷a愃嶧福ǎ校酰潁椋睿邋澹危酰悖歟澹錚螅椋洌邋澹校瑁錚螅穡瑁錚潁歟┦親畛１揮糜諉阜ê銑桑遙攏值拿�，以其催化囊h蘸停裕茫廖從渲�，窂摩式峙d褂玫模校危校幔螅邋澹睿輟鼉梢陰６談司粒裕茫常梗常保被潁裕眩梗滴⑸鎰魑岡磁嘌⑹占玫�。虽然蕦�(dǎo)什僮髦蟹從ξ徊絞劍�，但蕦�(dǎo)飾講劍紫群頌槍┨搴塑招柙冢校危校幔螅宓淖饔孟鹵環(huán)紙獬啥雜Φ募釕躋裕保姿幔緩蠛頌牽保姿嵩儆肓恚�？庚_孜鍇疤邐鎦剩裕茫獵冢校危校幔螅宓淖饔銑桑遙攏鄭謖飧齬討�，包含奋磷藥F腿チ姿嶧墓蹋虼誦杼峁�，后并没Q囅牧姿岣�，但整庚b從Υτ諏姿嵫位肪持懈欣冢矗福薄Ｎ⑸錈阜ㄏ啾扔諢Хê銑杉胺⒔頭ň哂幸韻錄父鲇諾悖海ǎ保┓�？６０�

本文編號(hào)：2654856