【摘要】：天然產(chǎn)物(NPs)具有化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多樣且生物活性廣泛的特點(diǎn),是現(xiàn)代藥物開(kāi)發(fā)的重要寶藏。然而,基于NPs的藥物發(fā)現(xiàn)充滿了挑戰(zhàn)。除了面臨最大程度地獲取多樣性單體結(jié)構(gòu)的諸多難題外,缺乏恰當(dāng)?shù)母咄亢Y選(HTS)方法以及對(duì)NP分子機(jī)制及其靶標(biāo)的認(rèn)識(shí)不足極大地阻礙了NP藥物的發(fā)現(xiàn)與臨床轉(zhuǎn)化。近年來(lái),各類組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展以及以高內(nèi)涵分析為代表的藥物篩選技術(shù)能力的日益完善,極大地加快了NP特征的識(shí)別速度,為高效的NP藥物發(fā)現(xiàn)提供了新的契機(jī)。C1050是車永勝研究員根據(jù)元寶槭內(nèi)生真菌Paraconiothyrium brasiliense發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新倍半萜類化合物(XY172)的結(jié)構(gòu),改構(gòu)優(yōu)化后獲得的全新結(jié)構(gòu)化合物。初步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該化合物不僅保持了XY172的腫瘤細(xì)胞選擇性,還具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。為了進(jìn)一步明確化合物C1050的抗腫瘤活性及選擇性,為其進(jìn)一步研發(fā)提供依據(jù),本課題首先采用MTT和CCK8法在24株貼壁腫瘤細(xì)胞(包括2株不同來(lái)源HeLa和HepG2、3株不同來(lái)源的MCF7以及HO8910等實(shí)體瘤細(xì)胞)、2株血液腫瘤細(xì)胞(K562和HL-60)及2株正常細(xì)胞(HUVEC和NIH3T3)上,對(duì)化合物C1050和XY172的抗腫瘤活性進(jìn)行篩查;其次,采用SRB法在化合物敏感細(xì)胞及其相關(guān)的7株細(xì)胞(HeLa-ATCC、HeLa-自存、HepG2-自存、HepG2-ATCC、C-33A、BEL7402、PLC/PRF/5)上進(jìn)行了抗腫瘤活性的確證;并通過(guò)腫瘤細(xì)胞集落形成和3D腫瘤球?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)了C1050的體外抗腫瘤活性。在此基礎(chǔ)上,分別采用高內(nèi)涵分析(HCA)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、qRT-PCR及Western blot等方法,從細(xì)胞表型譜特征和分子機(jī)制兩個(gè)層次系統(tǒng)地篩查和研究了化合物C1050的抗腫瘤作用機(jī)制。獲得以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.化合物C1050濃度依賴地抑制4株腫瘤細(xì)胞HeLa-ATCC、HepG2-自存、HO8910及MCF7-自存1的活性和增殖,IC_(50)值分別為0.64、0.93、3.26、4.33μM。在50?M對(duì)其它22株腫瘤細(xì)胞(包括相同背景不同來(lái)源實(shí)體腫瘤以及血液腫瘤細(xì)胞)抑制活性均小于40%(7株細(xì)胞小于20%),對(duì)正常細(xì)胞的抑制活性均小于10%。C1050的抗腫瘤活性強(qiáng)于其先導(dǎo)物XY172約7-15倍,但具有類似的腫瘤細(xì)胞的選擇性;2.化合物C1050濃度依賴地抑制HeLa-ATCC和HepG2-自存細(xì)胞集落形成,抑制HeLa-ATCC腫瘤細(xì)胞球的生長(zhǎng);3.化合物C1050濃度依賴地誘導(dǎo)Caspase依賴的HeLa-ATCC細(xì)胞凋亡;其誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡不受程序性壞死抑制劑Necrostatin-1,細(xì)胞自噬阻滯劑羥氯喹(HCQ)所影響;4.細(xì)胞毒表型、細(xì)胞骨架表型和細(xì)胞周期分析顯示,化合物C1050濃度依賴地增加HeLa-ATCC細(xì)胞核膜通透性(NMP)(0.1-30?M);降低細(xì)胞存活數(shù)量,改變細(xì)胞核形態(tài),降低線粒體膜電位(MMP)(0.3-30?M);誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯(1-3?M);使微絲和微管含量增加,張力微絲增粗,胞體增大,微管在核周聚集(3-30?M);14個(gè)腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路和5個(gè)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)通路篩查顯示,C1050僅在3?M濃度下抑制EGFR通路激活,最大抑制率約50%,而對(duì)其它通路無(wú)影響;5.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的GO分析顯示,C1050處理HeLa-ATCC細(xì)胞6-12 h,時(shí)間依賴地上調(diào)未折疊蛋白反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的mRNA;作用24 h,細(xì)胞核糖體功能基因顯著上調(diào),有絲分裂及微管細(xì)胞骨架相關(guān)基因顯著下調(diào)。在HepG2-自存細(xì)胞上結(jié)果類似。qRT-PCR驗(yàn)證證明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因DDIT3、CTH、ATF3、FGF21、CHAC1表達(dá)水平升高。6.Western blot分析顯示,C1050時(shí)間依賴地(0.5,1,2,6,12 h)升高p-PERK和CHOP蛋白的表達(dá)量,而IRE1α、p-IRE1α、PERK和ATF4蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間增加呈先升高后降低的趨勢(shì),表明C1050激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡相關(guān)的通路。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論:全新結(jié)構(gòu)化合物C1050具有特異的HeLa腫瘤細(xì)胞的選擇性及體外抗HeLa腫瘤活性;C1050抗腫瘤作用可能是通過(guò)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4-CHOP通路的激活,誘發(fā)caspase依賴的細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。NMP增加,MMP降低可能參與了C1050誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究為化合物C1050的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

%是非常確定僅屬于化學(xué)合成的小分子外，其來(lái)源產(chǎn)物及其衍生物和模擬 NP 的半合成產(chǎn)物物合成的化合物占 19%（圖 1）；而用于癌癥中，NP 來(lái)源藥物或基于天然產(chǎn)物改造的衍生些抗腫瘤藥物[4, 9]包括微生物來(lái)源的 DNA 裂解劑二環(huán)肽放線菌素 D，拓?fù)洚悩?gòu)酶 II 抑制劑羅米地辛（romidepsin）；來(lái)自植物的微管蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 抑制劑喜樹堿及其水溶性半合成制劑依托泊苷（鬼臼毒素相關(guān)的半合成劑），macetaxine mepesuccinate），軟海綿來(lái)源的艾）。此外，一些具有極強(qiáng)細(xì)胞毒的 NPs 包括海兔毒素，作為抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）中性遞送的目的�？梢钥闯觯@些抗腫瘤藥物瘤作用機(jī)制。NPs 在抗腫瘤藥物中具有不可或 NP 作為新藥開(kāi)發(fā)的起點(diǎn)是開(kāi)發(fā)新型治療藥物

研究技術(shù)路線圖
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2654577