【摘要】：葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)在多種腫瘤細胞中特異性高表達,高表達的GRP78在腫瘤細胞中具有定位多樣性,且具有多樣化的促癌效應。值得注意的是,GRP78不但可以定位于胞內,還可通過外泌體途徑被腫瘤細胞分泌到腫瘤微環(huán)境中,從而發(fā)揮促腫瘤作用。因此尋找能夠阻斷GRP78分泌的小分子抑制劑,將提高化療藥物的抗癌效率,為癌癥治療打開新的突破口。為了發(fā)現(xiàn)GRP78分泌的潛在抑制劑,我們將從以下幾個方面進行研究:1.通過檢測多種結腸癌細胞系及正常腸上皮細胞的培養(yǎng)基中GRP78的含量,發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞能特異性分泌GRP78,且結腸癌細胞系中DLD1分泌的GRP78含量較高,而HCT-116分泌的GRP78相對較少。而將GRP78的K633位點突變?yōu)楣劝滨０泛?腸癌細胞的GRP78分泌量明顯降低,表明K633位點對GRP78的分泌具有重要作用。此外,通過細胞共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn),GRP78的分泌能促進HUVEC細胞的血管生成能力。表明分泌型GRP78在微環(huán)境中能發(fā)揮促腫瘤相關血管生成的作用。2.運用虛擬篩選及分子對接等技術在虛擬平臺創(chuàng)建多種小分子的藥物結構與GRP78蛋白結構間三維水平的相互作用模型,從而在51種中藥分子中發(fā)現(xiàn)了5種與GRP78相互作用力較強且結合方式多樣化的小分子。這5種中藥小分子分別是:丹酚酸A(Salvianolic acid A,SAA)、柚皮苷(Naringin)、桔梗皂苷D(Platycodin D)、地奧司明(Diosmin)和異牡荊素(Isovitexin)。3.通過使用蛋白免疫印跡在細胞水平的驗證,發(fā)現(xiàn)丹酚酸A能夠有效抑制GRP78的分泌。此外,小分子與蛋白相互作用的研究揭示SAA可與GRP78的633位的賴氨酸殘基(K633)發(fā)生相互作用,且具有極強的親和力,從而發(fā)揮其抑制GRP78分泌的效應。研究還發(fā)現(xiàn)丹酚酸A能夠通過阻斷GRP78的分泌干預腫瘤相關血管生成。4.研究發(fā)現(xiàn)SAA-GRP78復合物的形成,能夠促進細胞溶質中GRP78分選進入溶酶體降解途徑而不是被外泌體分泌。體內實驗結果顯示,丹酚酸A能降低瘤體內VEGF表達量,抑制瘤塊生長,即丹酚酸A通過改善腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抑癌作用。
【圖文】：

Figure 1.1 The tumor microenvironment at a glance1.1.2 腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)展中的作用生物體內細胞與其微環(huán)境間的通訊機制對維持組織穩(wěn)態(tài)是至關重要的。此外，在實體瘤內腫瘤細胞和相關基質之間的相互作用影響著疾病發(fā)生、進展和患者預后的強大網絡關系[19]。例如，在癌癥發(fā)展進程中，癌細胞必須與攜帶膠原，透明質酸（HA）和腫瘤促進因子的ECM形成附著。腫瘤細胞和TME間的作用方式主要分為兩大類：接觸依賴性機制和非接觸依賴性機制，在非接觸依賴性機制中，可溶性分子如生長因子，趨化因子和細胞因子和可溶性亞細胞器，包括微泡和外泌體，它們相互作用并通過旁分泌機制激活。腫瘤微環(huán)境通過連續(xù)的旁分泌通訊和基質細胞與癌細胞同時進入活化狀態(tài)，形成動態(tài)信號回路，其中多種分子協(xié)同促進腫瘤擴張和侵襲，最終導致惡性進程[20, 21]。在腫瘤免疫逃逸方面，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞不僅失去了抗腫瘤效應，反而還被用于促進腫瘤生長。例如，存在于腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞被稱為腫瘤相關巨噬細胞，它被重新編程通過釋放抑制性細胞因子，如 IL-10、前列腺素或活性氧（ROS）

圖 1.2 腫瘤相關 管 成 式[35]Figure 1.2 The way of tumor angiogenesis原發(fā)性癌很少導致患者死亡（肺癌和肝癌除外），而大多數(shù)癌相關死亡是由癌細胞轉移引起的并發(fā)癥所導致。對于大多數(shù)惡性腫瘤，轉移的重要步驟之一是癌細胞必須形成新的血管系統(tǒng)。通常，瘤塊越大，瘤體內的血管密度越高，腫瘤細胞逃逸幾率越大。對于離開血液循環(huán)的大多數(shù)單個癌細胞要么凋亡，要么被免疫細胞消除，要么只保持休眠狀態(tài)不實現(xiàn)繼發(fā)性腫瘤的形成[38]。論證腫瘤相關血管生成和腫瘤轉移的有力證據(jù)之一，是腫瘤微血管密度與幾乎所有形式的惡性腫瘤中轉移潛能的增加和存活率差相關。此外，血管生成對于癌細胞肺轉移的形成至關重要。一些研究表明，骨髓來源的 EPC 有助于腫瘤轉移性生長的早期血管生成[39]，而另一些研究則認為正常血管的合并是轉移性血管形成的機制。此外，周細胞也在腫瘤轉移中發(fā)揮作用，，它有助于控制毛細血管腔的通暢性，MMP9敲除小鼠缺乏周細胞，血管形態(tài)塌陷，轉移減少。臨床前試驗中的抗血管生成療法可
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2651953