【摘要】：目前,全球黑色素瘤發(fā)病率逐漸上升,其生存率低、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高,極大威脅了患者的生命。對(duì)此,本課題采用光控基因表達(dá)技術(shù)以及腫瘤免疫的方法來(lái)治療黑色素瘤。本文擬采用維生素E琥珀酸酯(VES)和聚乙烯亞胺(PEI),通過(guò)引入二硫鍵(-ss-)合成兩親性VES-ss-PEI聚合物,在水中自組裝制備陽(yáng)離子膠束,采用靜電吸附作用包載抗原卵清蛋白或白喉毒素基因等藥物,載藥膠束仍呈正電性,通過(guò)靜電相互作用力包被由聚乙二醇(PEG)連有Arg-Gly-Asp(RGD)三肽的透明質(zhì)酸(HA)外殼HA-PEG-RGD,構(gòu)建納米遞藥系統(tǒng)。采用光控基因表達(dá)技術(shù),白喉毒素pDNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生白喉毒素,來(lái)殺滅腫瘤細(xì)胞;采用卵清蛋白(OVA)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生抗原性,利用激活的特異性免疫細(xì)胞來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng),通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究黑色素瘤的抑制效果,為治療黑色素瘤的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。首先合成了載體材料VES-ss-PEI與HA-PEG-RGD,通過(guò)核磁氫譜、核磁碳譜、紅外光譜等手段確定材料的成功合成。采用超聲法制備陽(yáng)離子納米膠束VES-ss-PEI,其粒徑范圍在50.8～70.4 nm,電位在48.8～53.4 mV之間。進(jìn)一步在表面包被多功能外殼,制備得到VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束,其粒徑范圍在64.4～82.8 nm,電位在-16.7～-41.2 mV之間。制備的納米膠束球形完整,粒徑均一,具有優(yōu)良的體內(nèi)外穩(wěn)定性。采用近紅外染料IR-775考察納米膠束在體內(nèi)的分布特性。結(jié)果表明,與游離IR-775組相比,IR-775@VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束組的血中AUC0-2h增加4.4倍,肝臟和脾臟中AUC0-24 h分別增加3.3倍和1.5倍,活體成像實(shí)驗(yàn)表明該納米膠束具有腫瘤靶向能力的同時(shí),也會(huì)富集于肝臟和脾臟中。利用靜電吸附作用包載卵清蛋白(OVA),采用超聲法制備得到了粒徑為55.9 nm的OVA@VES-g-PEI納米膠束,OVA載藥率為28.8%,通過(guò)靜電吸附作用包被多功能外殼制得OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI納米膠束,其粒徑增大到72.1 nm。OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI納米膠束在pH 7.4的PBS釋放介質(zhì)中具有一定的緩釋效果。與游離OVA組相比,OVA@mPEG-g-HA/VES-g-PEI納米膠束組能顯著提高細(xì)胞對(duì)蛋白的攝取能力(p0.01),能夠幫助蛋白從溶酶體中逃逸,逃逸的蛋白能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加工成短肽并形成MHC I-OVA257-264復(fù)合物標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞表面,同時(shí)能顯著增加樹(shù)突細(xì)胞表面標(biāo)志物CD80和CD86的表達(dá)量,表明mPEG-g-HA/OVA@VES-g-PEI納米膠束能有效刺激樹(shù)突細(xì)胞并使其成熟,具有明顯的抑瘤效果�？疾觳煌琋/P條件下載基因納米膠束的粒徑、電位、包載基因能力、穩(wěn)定性確定最佳N/P為10,并制備得到pDNA@VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束。該納米膠束能提升基因穩(wěn)定性,在PBS溶液和含有10 mM的谷胱甘肽還原酶(GSH)的PBS溶液中,72 h時(shí)基因累計(jì)釋放率分別為14.3%和62.0%,表明其具有還原敏感性。細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,包載光控綠色熒光蛋白基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束能顯著提高基因的攝取和轉(zhuǎn)染能力,通過(guò)控制藍(lán)光照射強(qiáng)度,能調(diào)控綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量。體外MTT實(shí)驗(yàn)、3D腫瘤球?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明,包載光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束經(jīng)過(guò)藍(lán)光照射后具有明顯的腫瘤細(xì)胞抑制能力。小鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)光控基因表達(dá)系統(tǒng)治療的荷瘤小鼠,與腫瘤模型組相比,包載光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束組的腫瘤抑制率為79.2%,荷瘤小鼠的生存率從10%提高到了100%,顯示出其具有顯著的腫瘤抑制能力。腫瘤組織切片染色實(shí)驗(yàn)表明,腫瘤細(xì)胞有明顯損傷,腫瘤新生血管細(xì)胞數(shù)量明顯減少,表明包載光控白喉毒素基因的VES-ss-PEI/HA-PEG-RGD納米膠束在經(jīng)過(guò)藍(lán)光照射治療后能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng),組織臟器切片染色實(shí)驗(yàn)表明,藍(lán)光未照射的組織無(wú)明顯毒副作用。初步考察了光控基因表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合OVA免疫的抗黑色素瘤效果,為光控基因表達(dá)免疫白喉毒素與免疫治療聯(lián)合治療黑色素瘤的治療新策略提供理論依據(jù)。
【圖文】：

通過(guò)雙功能聚乙二醇（ＰＥＧ）、透明質(zhì)酸（ＨＡ）與Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ三肽（ＲＧＤ）逡逑合成ＨＡ－ＰＥＧ－ＲＧＤ，通過(guò)靜電相互作用力包被在載藥膠束表面構(gòu)建免疫納米遞藥系統(tǒng)逡逑（見(jiàn)圖１．５）。利用光控基因表達(dá)系統(tǒng)可控地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)白喉毒素的Ａ片段（ＤＴＡ）逡逑蛋白催化ＮＡＤ＋上的ＡＤＰ核糖基向ＥＦ－２轉(zhuǎn)移，，進(jìn)而抑制細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成而表現(xiàn)逡逑毒性來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞及腫瘤新生血管細(xì)胞（見(jiàn)閣１．６途徑①）。由白喉毒素殺死的腫瘤細(xì)逡逑胞釋放出癌癥相關(guān)抗原經(jīng)樹(shù)突細(xì)胞呈遞后激活Ｔ細(xì)胞，從而X椉又琢鑾潁韻赴氖義狹浚跡保鍛揪盯郟�。同时利用聛嗗蛋白（Ｏ｀嵙）作为惋劶児原，栽r恢琢魷赴閎『簀義

本文編號(hào)：2651684