【摘要】：目的:合成并鑒定兩色金雞菊中活性成分黃諾馬苷(Flavanomarein,FM)的人工抗原,免疫動物產(chǎn)生抗黃諾馬苷的單克隆抗體,為兩色金雞菊及FM的免疫學(xué)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法:1.運用高碘酸氧化法將黃諾馬苷與牛血清白蛋白(BSA)及人血清白蛋白(HSA)偶聯(lián),形成FM-BSA和FM-HSA人工抗原;運用曼尼希法(M annich)將黃諾馬苷與陽離子化的牛血清白蛋白(cBSA)以及多聚賴氨酸(PLL)偶聯(lián),形成FM-cBSA和FM-PLL人工抗原;2.采用薄層色譜法對人工抗原進行鑒定,基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定FM-BSA和FM-HSA人工抗原的偶聯(lián)比。3.采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測FM-cBSA和FM-PLL的蛋白濃度。4.采用合成的人工抗原FM-BSA、FM-cBSA和FM-PLL免疫BALB/c小鼠,FM-HSA免疫新西蘭白兔。5.間接酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清抗體的效價,間接競爭ELISA法檢測抗血清中抗體的特異性。6.硫酸銨沉淀法粗提兔血清中的單克隆抗體。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定單克隆抗體。7.采用間接競爭ELISA法檢測抗黃諾馬苷的單克隆抗體與其他化合物的交叉反應(yīng)率。結(jié)果:1.薄層色譜結(jié)果顯示人工抗原均偶聯(lián)成功。2.MALDI-TOF-MS結(jié)果顯示FM-BSA和FM-HSA的偶聯(lián)比分別為4.77∶l和5.52∶l。3.蛋白濃度測定結(jié)果顯示FM-cBSA和FM-PLL的蛋白濃度分別為1.44和0.61 mg·mL~(-1)。4.間接競爭ELISA結(jié)果顯示,由FM-BSA、FM-cBSA和FM-PLL免疫的小鼠未產(chǎn)生穩(wěn)定的抗黃諾馬苷抗體,由FM-HSA免疫的新西蘭白兔均產(chǎn)生了穩(wěn)定的抗黃諾馬苷單克隆抗體,檢測范圍10-160 ng·m L~(-1)。結(jié)論:成功合成黃諾馬苷人工抗原,得到黃諾馬苷單克隆抗體及黃諾馬苷的ELISA檢測方法,為兩色金雞菊及FM的免疫分析方法奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖2 FM-cBSA的薄層色譜圖Figure2 TLC of FM-cBSA層鑒定結(jié)果在相同的展開條件，366 nm 紫外燈照射下，由于 PLL 是大分子蛋白物質(zhì)，在相同的展開6 nm 紫外燈照射下也不會呈現(xiàn)相應(yīng)的熒光斑照射下，合成產(chǎn)物 FM-PLL 并沒有在與 FM 相應(yīng)的熒光斑點。由此可以判斷，該人工抗原的斑點，表明完全純化去除小分子。

新疆醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文1.4 FM-BSA 和 FM-HSA 的 MALDI-TOF-MS 鑒定圖 4-圖 7 分別為 BSA，HSA，，F(xiàn)M-BSA，F(xiàn)M-HSA 的質(zhì)譜圖。由圖 2 可知 BS的相對分子量（Mr）為 66770，由圖 3 可知 HSA 的 Mr 為 66841，由圖 4 可知 FM-BS的 Mr 為 68917，由圖 5 可知 FM-HSA 的 Mr 為 69327，已知 FM 的 Mr 是 450.4，該結(jié)果表明FM-BSA中，每個載體蛋白BSA分子上偶聯(lián)有4個[(68917-66770)/450.4] FM分子，該結(jié)果表明在 FM-HSA 中，每個 HSA 分子上連接有 5 個[(69327-66841)/450.4FM 分子，顯示人工抗原合成成功，能夠用于動物的免疫。
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R914

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本文編號：2651557