【摘要】：微生物特別是放線菌是天然產物藥物的主要來源,至今已從放線菌中分離得到超過10000種生物活性物質。上世紀80年代后對放線菌菌株的反復發(fā)現(xiàn)和分離,致使從放線菌中分離得到的重復化合物越來越多,研究人員一度以為微生物天然產物資源已經(jīng)枯竭。然而,基因組測序結果顯示,許多微生物含有大量的可能編碼新穎次級代謝產物的基因簇,只是受傳統(tǒng)挖掘方法的限制不能被完全發(fā)掘,基于此種背景,各種基因組挖掘方法應運而生,并在天然產物發(fā)現(xiàn)領域發(fā)揮著越來越重要的作用。本論文嘗試對三株AHBA合酶基因陽性菌包括一株鏈霉菌(LC6)和兩株稀有放線菌(疣孢菌NS0172和小單孢菌FXYA29)進行基因組挖掘,從中發(fā)現(xiàn)新結構或活性天然產物。Juanlimycin A和B是本實驗室前期從鏈霉菌LC6中分離得到的新穎二聚化五酮安莎霉素,為獲得更多的juanlimycin類化合物并開展其生物合成研究,我們通過敲除競爭代謝產物十一烷基因靈菌紅素基因簇Red和過表達途徑專一性正調控基因嘗試提高juanlimycin類化合物的產量與類型。本論文使用SFM培養(yǎng)基對LC6-deRED-SARP突變株進行了 95 L大規(guī)模發(fā)酵,通過HPLC指導的追蹤分離,從中分離鑒定了 A、F、H和I四個化合物,其中A和I為juanlimycin類新化合物。我們還嘗試通過調控基因過表達和啟動子工程對疣孢菌NS0172和小單孢菌FXY A29進行沉默基因簇激活并分離鑒定其次級代謝產物。在前期遺傳操作方法的基礎上,我們進一步通過摸索孢子萌發(fā)條件和孢子熱激條件顯著提高了接合轉移效率,為后續(xù)工作奠定了良好的基礎。在疣孢菌NS0172中,通過兩輪啟動子替換,我們部分“激活”了Ⅱ型PKS-NRPS雜合基因簇NS0172-GC2,從突變株NS0172-GC2-1中分離得到兩個化合物Al,A2,其中Al經(jīng)核磁鑒定為鄰-(4-羧基-1-丁烯基)苯丙酸,A2為鄰-5-羥基-6-羧基已烯基苯丙酸。Al和A2推測由Ⅱ型聚酮樣亞基因簇orf50-59負責合成,但還需要進一步的基因敲除實驗進行證實或證偽。此外,通過表達SARP家族調控基因orf39我們獲得了突變株0172-GC5-SARP,該突變株提取物呈現(xiàn)墨綠色,與野生型相比存在多個差異峰。突變株發(fā)酵時培養(yǎng)基沒有顏色變化,但產生大量黑色油狀孢子,我們推測提取物中墨綠色成份是某種“孢子色素”。我們使用YMG培養(yǎng)基對該突變株進行5L發(fā)酵和目標化合物的分離,但墨綠色成份由于難溶于常用有機溶液,未能獲得純化與結構鑒定;另外275 nm下出現(xiàn)幾個差異峰化合物量較少,也未能鑒定結構,需要進一步擴大發(fā)酵規(guī)模或優(yōu)化發(fā)酵條件后再進行分離。在小單孢菌FXY A29中,我們嘗試對GCl(PKS-NRPS-Lantibiotic雜合基因簇)、GC9(Type ⅡPKS基因簇)和GC15(trans-ATPKS-NRPS雜合基因簇)進行了激活。從雙向啟動子替換突變株A29-GC1中我們分離獲得了化合物B1和B2,令人意外的是,B1與NS0172-GC2-1突變株中獲得的A1結構完全相同,盡管在A29的基因組中存在2條Ⅱ型聚酮途徑,但與NS00172-GC2的Ⅱ型聚酮樣亞基因簇存在較大差異。在已經(jīng)排除發(fā)酵過程污染的情況下,我們推測可能原因有:1)由于基因組序列不完整造成某些序列丟失;2)A29中采用不同的途徑合成該類化合物。使用與A29-GCl相同的啟動子替換策略,我們對GC15進行兩輪替換分別獲得了 A29-GC15-1和A29-GC15-2突變株,其中A29-GC15-2突變株與野生型相比有兩個明顯的差異峰B3和B4,由于分離過程中發(fā)生了轉化或降解,這兩個化合物未能獲得鑒定,需要重新發(fā)酵并改進分離方法,嘗試在低溫或避光條件下進行分離。綜上所述,在對兩株稀有放線菌進行接合轉移條件優(yōu)化的基礎上,我們使用多種策略對上述三株放線菌中多條次級代謝途徑進行了產物挖掘,鑒定了2種類型至少4個新化合物。挖掘工作總體存在工作量大、成功率低等問題。因此,對于遺傳操作困難且生長緩慢的稀有放線菌或其它微生物,啟動子替換與調控基因過表達這兩種常用挖掘策略可能并不是非常好的選擇,而繞過原始菌遺傳操作的“通過合成生物學策略進行體外途徑組裝并在合適的放線菌底盤中進行異源表達”或者僅需要簡單遺傳操作的“培養(yǎng)基優(yōu)化與雙報告基因選擇”等方法可能更適用于(稀有)放線菌新天然產物的的挖掘。
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Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ邐Ｒｏｓａｒａｍｉｃｉｎ逡逑圖１．２稀有放線菌中分離得到的化合物逡逑２．聚酮類與非核糖體肽類化合物逡逑由聚酮合酶（ＰＫＳ）催化合成的聚酮類化合物（ＰＫｓ），是天然產物中的一－大逡逑家族，許多抗生素如紅霉素、阿維菌素、四環(huán)素等都是聚酮類抗生素６。目前己逡逑知的ＰＫＳ可以分為三大類：丨型、丨丨型和丨丨丨型。逡逑Ｉ型ＰＫＳ是一個巨型多功能酶復合體，可分為迭代型（丨ｔｅｒａｔｉｖｅ）與模塊型逡逑（Ｍｏｄｕｌｅ）。ＵｅｒａｔｉｖｅＰＫＳ邋（ｉＰＫＳ）存在于真菌和細菌中，催化合成芳香聚酮類，，逡逑烯：炔類等化合物。Ｍｏｄｕｌｅ邋ＰＫＳ邋（ｍｏｄＰＫＳ）則主要存在于細菌中，催化合成大逡逑環(huán)內酯類，多烯類．聚醚類等化合物１８。本論文主要對ｍｏｄＰＫＳ進行研[�。ｍｅP洌校耍渝義希插義

本文編號：2651111