【摘要】：臨床治療藥物監(jiān)測(TDM),作為實(shí)現(xiàn)患者個(gè)體化治療的重要手段之一,其在臨床上的普及很好地保障了臨床患者用藥的安全性及有效性,有力地支持了精準(zhǔn)醫(yī)療工作的開展。其中,對臨床生物樣本進(jìn)行分析是實(shí)現(xiàn)TDM的重要手段之一。無論是臨床生物樣本還是普通健康受試者生物樣本,其中都含有大量的內(nèi)源性大分子,使得分析結(jié)果易受基質(zhì)效應(yīng)的影響,因此在分析前,往往需要對樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)厍疤幚?將待測組份從生物樣品基質(zhì)中分離出來,以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。目前常用的生物樣本前處理方法主要有蛋白沉淀法(PPT)、液液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)等,這些方法往往是使用健康志愿者的血漿進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,但是,臨床生物樣本的狀態(tài)與健康志愿者明顯不同,健康志愿者的生物樣本狀態(tài)相對穩(wěn)定,所造成的基質(zhì)效應(yīng)變異度小,而臨床患者的生物樣本狀態(tài)往往因受疾病狀態(tài)的影響而變現(xiàn)出很大的個(gè)體差異,導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)差別顯著,因此,臨床樣本分析結(jié)果的準(zhǔn)確性不易得到保障。有研究表明,臨床患者血液樣本的粘度、蛋白濃度、膠體滲透壓等都極易受到疾病狀態(tài)的影響,表現(xiàn)出很大的變異性,而蛋白沉淀量、萃取效率等極易受到這些因素等影響,因此,在使用PPT、LLE或SPE處理不同臨床患者的血樣時(shí),即便是加入的沉淀劑或萃取劑的量完全相同,也很容易導(dǎo)致待測物的回收率不同,從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外,傳統(tǒng)的生物樣本前處理方法檢測指標(biāo)單一,通常僅能用于總藥物濃度(Ct)或游離藥物濃度(Cf)的檢測,而Ct或Cf易受到采樣時(shí)間、用藥時(shí)長、進(jìn)食等因素的影響。在普通的生物樣本研究中,這些因素都會(huì)被嚴(yán)格地控制,此時(shí),測定的Ct或Cf可以較為準(zhǔn)確地反應(yīng)機(jī)體整體的用藥情況。但是,在對臨床患者進(jìn)行研究或日常監(jiān)測時(shí),患者的采樣點(diǎn)、進(jìn)食時(shí)間、食物種類等,都不容易像非臨床生物樣本研究一樣被嚴(yán)格控制,因此,所測定得Ct或Cf可能很難真實(shí)地反應(yīng)體內(nèi)藥物水平。同時(shí)傳統(tǒng)前處理方法還存在著操作復(fù)雜、耗時(shí)長等問題,對結(jié)果的準(zhǔn)確性、分析效率造成影響。由于傳統(tǒng)樣品前處理方法并未考慮到臨床樣本的特殊性,分析結(jié)果往往給臨床研究及日常TDM帶來了許多困惑,甚至影響到患者的個(gè)體化治療效果。因此,建立簡便、準(zhǔn)確、適當(dāng)且免于疾病狀態(tài)干擾的臨床生物樣本前處理方法,是保障測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、測定指標(biāo)的合理性、提高方法的普及性的關(guān)鍵因素,可為臨床生物樣本日常檢測以及藥物藥效學(xué)關(guān)系的研究提供可靠地分析平臺(tái),更好地保證臨床患者用藥安全有效,提高治療效果,降低毒副反應(yīng)。第一部分集血樣采集與處理于一體的新型生物樣品前處理方法目的:將封閉技術(shù)與中空纖維超濾法(FE-HFCF-UF)相結(jié)合,建立一個(gè)簡單、有效、免處理的生物樣品前處理方法,用于保障臨床生物樣本分析結(jié)果的真實(shí)性,同時(shí)提高了分析過程的生物安全性。方法:以阿德福韋和替諾福韋為模型藥物,將封閉技術(shù)與直接進(jìn)樣技術(shù)相結(jié)合,建立一個(gè)全封閉的中空纖維超濾技術(shù)。在負(fù)壓的作用下,約0.6 m L的全血樣品通過采血針進(jìn)入到超濾管中,采集完成后,輕輕震蕩超濾管,使管壁及中空纖維外壁上的抗凝劑溶解至全血中,得到抗凝血樣;然后,在25°C下,離心轉(zhuǎn)速為3500 r/min,離心20 min,從中空纖維內(nèi)腔約取出50μL超濾液,衍生后取20μL衍生液注入色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜條件:采用Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);阿德福韋和替諾福韋的流動(dòng)相分別為10 m M磷酸二氫鉀(內(nèi)含2 m M氫氧化四丁銨)-乙腈(88:12,v/v)和10 m M磷酸二氫鉀(內(nèi)含2 m M氫氧化四丁銨)-乙腈(90:10,v/v);流速為1.0 m L/min;柱溫為30°C;阿德福韋的激發(fā)波長為309 nm,發(fā)射波長為425 nm,替諾福韋的激發(fā)波長為254 nm,發(fā)射波長為425 nm.結(jié)果:測定結(jié)果顯示FE-HFCF-UF方法具有良好的精密度、靈敏度和回收率。日間和日內(nèi)精密度的RSD值均小于4.1%,絕對回收率可達(dá)100%。結(jié)論:該方法操作簡便,集血樣采集與樣品前處理于一體,僅需一步簡單離心,即可從全血中分離得到只含有小分子的超濾液,幾乎免除了人工操作,并且可以使用標(biāo)準(zhǔn)溶液代替加標(biāo)血樣去制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,免除了血漿狀態(tài)對結(jié)果的影響,保證了分析過程的簡便性、準(zhǔn)確性和靈敏度。此外,簡便的操作及封閉系統(tǒng)都提高了分析過程的安全性。由于新方法的種種優(yōu)良特性,有望為生物樣品分析提供了一個(gè)簡便、有效的分析平臺(tái),并為進(jìn)一步提高分析方法的生物安全提供了一個(gè)新的思路。第二部分氨茶堿蛋白結(jié)合率的測定以及其與藥物藥效學(xué)關(guān)系的研究目的:以中空纖維超濾(HFCF-UF)為基礎(chǔ)方法,測定臨床患者中氨茶堿(AYP)的蛋白結(jié)合率(PPB),并結(jié)合臨床患者信息探討氨茶堿(AYP)PPB的影響因素,為合理化用藥提供參考依據(jù)。方法:采用HFCF-UF方法,測定氨茶堿的游離濃度(Cf),再通過加入釋放劑的方法,使與蛋白相結(jié)合的氨茶堿游離出來,再次使用HFCF-UF法,測定氨茶堿總濃度(Ct),通過公式計(jì)算,得出氨茶堿PPB。色譜條件:采用Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流動(dòng)相為10mmol/L乙酸銨緩沖溶液與甲醇以80:20的比例混合,流速1.0 m L/min,檢測波長為275 nm,進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果:本研究對來自于80位患者的80份臨床樣本進(jìn)行了PPB測定,結(jié)果顯示PPB范圍為9.8%-98.1%。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),患者的性別、生理狀況、疾病狀態(tài)、合并用藥情況對AYP的PPB有影響作用。結(jié)論:患者群體中的氨茶堿PPB存在著極大的個(gè)體間差異,因此,有必要對使用AYP的臨床患者進(jìn)行PPB監(jiān)測,完善AYP的用藥信息,提高患者臨床用藥的安全性和有效性。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2650696