【摘要】：醋氨酚(又稱(chēng)對(duì)乙酰氨基酚,acetaminophen,APAP)是一種解熱鎮(zhèn)痛藥,存在于市面上多種復(fù)方感冒制劑中,過(guò)量使用時(shí),會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重急性肝臟毒性,導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、肝衰竭甚至造成死亡。APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型是研究藥物性肝損傷的經(jīng)典模型。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶家族的一個(gè)成員,在細(xì)胞受到環(huán)境或細(xì)胞因子刺激時(shí)會(huì)被激活,并參與調(diào)控細(xì)胞炎癥、凋亡、生長(zhǎng)、分化等過(guò)程。過(guò)量醋氨酚導(dǎo)致的藥物性肝損傷中存在氧化應(yīng)激,其可能與JNK的激活相關(guān)。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)是Ⅱ相代謝解毒酶之一,催化醋氨酚的有毒代謝產(chǎn)物N-乙酰對(duì)苯亞胺醌與谷胱甘肽結(jié)合,提高機(jī)體抗氧化水平和解毒功能。本研究在APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的基礎(chǔ)上,通過(guò)給予JNK選擇性抑制劑SP600125,確定JNK信號(hào)通路和GSTA1在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中的作用,為進(jìn)一步研究藥物性肝損傷機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)采用不同劑量APAP給予小鼠,通過(guò)檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性,確定可造成不同程度肝損傷的APAP劑量。在此模型基礎(chǔ)上通過(guò)檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶活性篩選JNK抑制劑SP600125的最適作用劑量。隨后進(jìn)行JNK信號(hào)通路和GSTA1在肝損傷中的作用研究。試驗(yàn)分為五組:對(duì)照組、低劑量APAP組(150 mg·kg~(-1) APAP)、高劑量APAP組(175mg·kg~(-1)APAP)、低劑量APAP+SP組(150 mg·kg~(-1) APAP+2 mg·kg~(-1) SP600125)、高劑量APAP+SP組(175 mg·kg~(-1) APAP+2 mg·kg~(-1) SP600125),應(yīng)用試劑盒檢測(cè)血清ALT、AST和肝組織指標(biāo)(MDA、SOD、GSH、GSH-Px)水平;應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清及肝組織中GSTA1的含量;應(yīng)用HE染色法對(duì)肝臟進(jìn)行病理組織學(xué)檢查;采用Hoechst 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;采用Western blot方法測(cè)定肝組織中p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos、c-Fos、p-ASK1、ASK1、p-MKK4、MKK4及GSTA1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)以上研究,明確在APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中JNK信號(hào)通路是否被激活以及JNK、GSTA1與藥物性肝損傷之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明:(1)應(yīng)用梯度劑量APAP給予小鼠灌胃12 h可對(duì)其造成不同程度的肝損傷。當(dāng)給藥劑量為150 mg·kg~(-1)時(shí),血清轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高(p0.05);當(dāng)給藥劑量為175 mg·kg~(-1)時(shí),血清轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著升高(p0.01)。最終確定以150 mg·kg~(-1)、175 mg·kg~(-1)作為可以造成不同程度肝損傷的醋氨酚劑量。(2)在肝損傷模型的基礎(chǔ)上,篩選出JNK抑制劑SP600125的最適作用劑量為2 mg·kg~(-1)。(3)JNK抑制劑作用小鼠后,與高劑量APAP組相比,高劑量APAP+SP組血清轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著下降(p0.01),肝組織中丙二醛含量顯著降低(p0.05),超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性極顯著升高(p0.01),血清和肝臟中GSTA1含量極顯著變化(p0.01);與低劑量APAP組相比,低劑量APAP+SP組肝組織中丙二醛含量顯著降低(p0.05),超氧化物歧化酶活性顯著升高(p0.05),谷胱甘肽含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性極顯著升高(p0.01),血清和肝臟中GSTA1含量極顯著變化(p0.01)。病理組織學(xué)檢查顯示低劑量APAP組有少量出血點(diǎn),肝索輕微紊亂,高劑量APAP組肝細(xì)胞索消失,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),淤血嚴(yán)重,細(xì)胞碎裂;低劑量APAP+SP組出血點(diǎn)明顯減少;高劑量APAP+SP組無(wú)出血點(diǎn),炎性細(xì)胞數(shù)量驟減,肝索排列規(guī)則。Hoechst 33258檢測(cè)凋亡結(jié)果表明,APAP組隨著劑量的增加,細(xì)胞發(fā)生凋亡的趨勢(shì)越明顯,細(xì)胞核固縮;給予JNK抑制劑后,細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯減少。以上結(jié)果表明JNK抑制劑減輕了APAP誘導(dǎo)的肝組織損傷和肝細(xì)胞凋亡。(4)JNK信號(hào)通路上下游蛋白的表達(dá)結(jié)果表明,不同劑量APAP組中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos、p-MKK4/MKK4、p-ASK1/ASK1比值均高于對(duì)照組,差異極顯著(p0.01);高劑量APAP+SP組p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-MKK4/MKK4、p-ASK1/ASK1比值低于高劑量APAP組;JNK抑制劑沒(méi)有降低p-c-Fos/c-Fos比值。說(shuō)明在小鼠不同程度肝損傷中,JNK信號(hào)通路被激活,JNK上下游蛋白磷酸化水平增加;給予JNK抑制劑后,JNK、c-Jun、ASK1、MKK4磷酸化水平下降,但c-Fos磷酸化水平?jīng)]有變化。表明JNK信號(hào)通路的激活和JNK上下游蛋白的磷酸化參與了APAP所致的肝損傷,與肝損傷程度呈正相關(guān)。(5)GSTA1蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示,不同劑量APAP組中GSTA1相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(p0.01);低劑量APAP+SP組GSTA1相對(duì)表達(dá)量顯著高于低劑量APAP組(p0.05);高劑量APAP+SP組GSTA1相對(duì)表達(dá)量極顯著高于高劑量APAP組(p0.01)。說(shuō)明APAP誘導(dǎo)的肝損傷中GSTA1表達(dá)量減少,給予JNK抑制劑后表達(dá)量增多,表明肝損傷發(fā)生時(shí)肝臟GSTA1的表達(dá)量降低,肝臟抵抗損傷的能力下降,JNK抑制劑通過(guò)抑制JNK的激活保護(hù)肝臟,GSTA1表達(dá)量上升,肝臟抵抗損傷的能力增強(qiáng)。本研究成功復(fù)制APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型,確定SP600125的最適作用劑量,在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷中,JNK信號(hào)通路被激活,應(yīng)用JNK抑制劑可以降低JNK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化,增加肝臟中GSTA1的表達(dá)量,減輕APAP引起的肝損傷和凋亡。明確JNK信號(hào)通路在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中的作用,該通路可能通過(guò)調(diào)控GSTA1的表達(dá)來(lái)抵抗過(guò)氧化損傷,但其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。
【圖文】：

圖 1-1 MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)途徑[57]Fig. 1-1 MAKP signaling transduction pathways JNK 信號(hào)通路相關(guān)研究NK 在細(xì)胞受到環(huán)境或細(xì)胞因子刺激（包括滲透性休克、發(fā)熱、缺氧、DNA 損傷度重金屬）時(shí)會(huì)被活化[58, 59]。研究表明，大部分生物過(guò)程（如細(xì)胞分化、凋亡都與 JNK 激活相關(guān)，因此 JNK 被看做是生理狀態(tài)與病理狀態(tài)的臨界點(diǎn)[60]。起初線(xiàn)菌酮處理的大鼠肝臟中分離出來(lái)的 54 kDa MAPK 蛋白[61]，JNK1 和 JNK2 在織器官均有表達(dá)，而 JNK3 僅選擇性的存在于大腦、心臟和睪丸中[62]。這三個(gè)達(dá) 10 個(gè)亞型，包括 4 個(gè) JNK1 亞型、4 個(gè) JNK2 亞型和 2 個(gè) JNK3 亞型[63]。化應(yīng)激可以導(dǎo)致 MAP3K 的激活，其中凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1（ASK1）參與了 JNK1位于 JNK信號(hào)通路的上游，通過(guò)激活 MKK-4/7激活 JNK。MKK4（MAP kinase MKK7（MAP kinase kinases 4）可以通過(guò)在 Thr183 和 Tyr185 的雙重磷酸化對(duì) 。在 JNK 信號(hào)級(jí)聯(lián)中，ASK1 可以激活 MAP2K（如 MKK4 和 MKK7），它們可游激酶 JNK。實(shí)驗(yàn)證明，ASK1 過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)凋亡而 ASK1 沉默表達(dá)抑制凋亡[64] 在應(yīng)激或細(xì)胞因子導(dǎo)致的凋亡中起調(diào)節(jié)作用。正常生理狀態(tài)下，ASK1 與硫氧還復(fù)合物，但是在病理狀態(tài)時(shí)，，在炎癥因子或氧化應(yīng)激存在的條件下，該復(fù)合物會(huì)

與分析酚誘導(dǎo)小鼠急性藥物性肝損傷模型的復(fù)制P 誘導(dǎo)小鼠急性藥物性肝損傷模型復(fù)制的試驗(yàn)中，各劑量組小鼠血化如圖 3-1 和圖 3-2 所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，150 mg·kg-1均顯著升高（p<0.05），175 mg·kg-1和 200 mg·kg-1APAP 組 ALT 和（p<0.01）。因此選擇 150 mg·kg-1和 175 mg·kg-1這兩個(gè)劑量用于后續(xù)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2650549