【摘要】：目的高效表達(dá)嗜熱脂肪芽胞桿菌色氨酰-tRNA合成酶(BsTrpRS),獲得創(chuàng)新霉素與BsTrpRS的復(fù)合物晶體,并利用X-ray進(jìn)行晶體衍射數(shù)據(jù)收集和晶體結(jié)構(gòu)程序解析復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬從分子水平揭示藥物與受體相互作用的機(jī)制,為藥物的設(shè)計(jì)與優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。方法1.構(gòu)建含有BsTrpRS蛋白目的基因的表達(dá)載體,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得TrpRS蛋白的可溶性表達(dá)。2.采用親和層析色譜、離子交換色譜和分子排阻色譜純化目的蛋白,以期獲得純度在90%以上的BsTrpRS,后通過表面等離子共振法(SPR)和等溫滴定量熱法(ITC)來檢測BsTrpRS的活性。3.選用氣相擴(kuò)散懸滴法,通過優(yōu)化結(jié)晶條件(包括蛋白濃度、沉淀劑濃度、溫度和pH等)獲得可進(jìn)行X-ray衍射的高質(zhì)量晶體,獲取衍射數(shù)據(jù)。4.采用共結(jié)晶法獲取BsTrpRS與創(chuàng)新霉素復(fù)合物的晶體。5.將得到的復(fù)合物晶體進(jìn)行X-ray衍射并收集數(shù)據(jù),解析復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),并結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬和定點(diǎn)突變驗(yàn)證,揭示創(chuàng)新霉素在BsTrpRS靶點(diǎn)的作用機(jī)制。結(jié)果1.運(yùn)用分子生物學(xué)方法成功構(gòu)建含BsTrpRS基因的重組質(zhì)粒,并通過優(yōu)化得到BsTrpRS蛋白高表達(dá)菌株BL21(DE3)。2.運(yùn)用親和層析、離子交換色譜和分子排阻色譜等蛋白純化下游技術(shù),獲得高純度BsTrpRS蛋白。3.通過SPR和ITC技術(shù),驗(yàn)證了BsTrpRS的活性,并確證了創(chuàng)新霉素與BsTrpRS之間具有高親和力。4.通過晶體篩選,獲得了X-ray衍射分辨率為2.06?的創(chuàng)新霉素*BsTrpRS二元復(fù)合物晶體和2.16?的創(chuàng)新霉素*ATP*BsTrpRS三元復(fù)合物晶體,并解析得到各自的復(fù)合物三維結(jié)構(gòu),結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬和定點(diǎn)突變驗(yàn)證,從分子水平揭示了創(chuàng)新霉素與BsTrpRS之間的相互作用機(jī)制。結(jié)論本研究從分子水平闡明了創(chuàng)新霉素與其靶點(diǎn)BsTrpRS相互作用的機(jī)制,為創(chuàng)新霉素與BsTrpRS的結(jié)合提供了確切的分子結(jié)構(gòu)模型,為后期篩選、設(shè)計(jì)藥效更好的創(chuàng)新霉素藥物打下理論基礎(chǔ)。圖34幅;表13個(gè);參111篇。
【圖文】：

華北理工大學(xué)碩士學(xué)位論文大小選擇所需濃度的瓊脂糖凝膠（如 0.9%，稱取TAE），置于微波爐中加熱使瓊脂糖完全溶解。搖勻后，倒入合適的模具中，檢查有無氣泡，插上完全凝固，拔出梳子，將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中液，浸過膠表面。 與上樣緩沖液混合，用移液槍將樣品加入樣品孔，。選擇合適的電壓，接通電源。待指示劑遷移至合凝膠在凝膠成像儀上觀察電泳結(jié)果，，并拍照保存。RS 重組質(zhì)粒構(gòu)建sTrpRS 與質(zhì)粒載體 pET-21a(+)分別用 Nde I 和 Xh組質(zhì)粒 pET-21a-BsTrpRS，如圖 1 所示。

配制： 5×Coomassie 濃縮液稀釋為 1×染液，后用普通濾紙將沉淀，4℃保存。蛋白梯度：mg mL-1的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液與 5 μL 稀釋液（Tri-HCl/PBL 2 mg mL-1的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，取 5 μL 依次倍比稀白溶液 4 mg mL-1、2 mg mL-1、1 mg mL-1、0.5 mg mLg mL-1、0.0625 mg mL-1、0.03125 mg mL-1、0.015625 mg 標(biāo)準(zhǔn)曲線：到低依次取 3 μL BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液分別與 300 μL 上述在 OD450 和 OD595 處讀取吸光度值。以 BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋95/OD450 為縱坐標(biāo) Y，利用 Excel 軟件制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R91

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 肖永紅;;國家細(xì)菌耐藥控制行動(dòng)計(jì)劃:基于大健康理念的耐藥控制宏圖[J];中華臨床感染病雜志;2016年04期

2 劉四化;王倩倩;肖良;張黎明;;蛋白質(zhì)結(jié)晶方法的研究進(jìn)展[J];中國生化藥物雜志;2011年05期

3 趙衛(wèi)光,李正名,王寶雷,王建國;高通量蛋白質(zhì)結(jié)晶及其在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用[J];化學(xué)進(jìn)展;2004年01期

4 王玉成;;創(chuàng)新霉素研究概況[J];中國藥學(xué)雜志;1992年09期

5 王立軍,戚天慶;脫硫創(chuàng)新霉素對E.coli B的抗菌作用和抗菌原發(fā)作用[J];抗生素;1984年05期

6 林赴田,閻桂華;在試管內(nèi)形成的耐創(chuàng)新霉素的大腸桿菌和痢疾桿菌的特性[J];抗生素;1980年05期

7 ;新抗菌素——?jiǎng)?chuàng)新霉素的研究[J];中國科學(xué);1976年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 林波;α-芋螺毒素與乙酰膽堿結(jié)合蛋白共結(jié)晶研究[D];海南大學(xué);2014年

本文編號：2650106