【摘要】：近些年來,藥用植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為開發(fā)新藥和新穎結(jié)構(gòu)化合物的重要來源之一,具有很重要的生態(tài)學(xué)與經(jīng)濟(jì)學(xué)意義,已經(jīng)成為了中藥學(xué)、微生物學(xué)、植物保護(hù)學(xué)等眾多學(xué)科研究的重點(diǎn)。甘肅省內(nèi)氣候類型多樣、生態(tài)類型眾多,因此孕育了種類豐富的野生藥用植物資源。文獻(xiàn)報(bào)道以藥用植物的化學(xué)成分的研究為主,對藥用植物的內(nèi)生真菌的種類與其次級代謝產(chǎn)物的研究較少。本研究以甘肅本地產(chǎn)的藿香為研究對象,對藿香中的內(nèi)生真菌的種類、內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗氧化、清除DPPH自由基活性及次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究,研究內(nèi)容與結(jié)果如下:從藥用植物藿香的花中,采用表面消毒法與組織分離法,分離純化得到13株內(nèi)生真菌。對其顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,分屬于絲核菌屬、黑孢霉屬、長蠕孢菌屬、短蠕孢菌屬、絲孢菌屬、鏈格孢菌屬、鐮刀菌屬和頭孢霉菌屬。將13株內(nèi)生真菌進(jìn)行少量液體發(fā)酵,用乙酸乙酯和正丁醇對13株內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行萃取,菌絲體乙醇回流提取,萃取完的菌液減壓蒸干,分別得到:菌液的乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位及菌絲體的乙醇提取物。用微量肉湯稀釋法與TLC-生物自顯影法對內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的各個(gè)部位的抗菌與DPPH自由基清除活性進(jìn)行測定。體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果顯示:具有抗菌活性的物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯部位與正丁醇部位,以乙酸乙酯部位為主。菌株H-2的次級代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯部位的抗菌活性最好,對六種供試細(xì)菌的MIC值為250μg/mL。菌株H-9的乙酸乙酯部位對無乳鏈球菌的MIC值均為31.25μg/mL,對其余五株供試細(xì)菌的MIC值為500μg/mL。而正丁醇部位也具有抗菌活性,菌株H-2、H-5、H-6、H-9的正丁醇部位對六種供試細(xì)菌的MIC值均為1000μg/mL。體外DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:具有清除DPPH自由基活性的物質(zhì)主要集中在內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯部位。在13株內(nèi)生真菌中,菌株H-9次級代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯部位清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)。當(dāng)DPPH甲醇溶液濃度為0.1%(w/v)時(shí),菌株H-9次級代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯部位清除DPPH自由基的單位面積清除率相當(dāng)于陽性對照0.75 mg/mL的Vc溶液的單位面積清除率的70.15±3.70%,菌株H-13的乙酸乙酯部位也具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力,其清除率相當(dāng)于陽性對照0.75 mg/mL的Vc溶液的單位清除率的48.84±4.68%。對菌株H-2和菌株H-9進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定分別為黑孢霉菌屬與鏈格孢菌屬。將實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的一株其次級代謝產(chǎn)物具有良好清除DPPH自由基活性的藿香內(nèi)生真菌Y-2作為研究對象,利用大孔樹脂柱、硅膠柱和Sephadex LH-20凝膠柱等色譜柱方法,并結(jié)合薄層層析色譜檢識,分離純化從發(fā)酵液的正丁醇部位中得到2個(gè)單體化合物,應(yīng)用核磁共振碳譜氫譜及質(zhì)譜對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,化合物1鑒定為5α,8α-環(huán)二氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇,化合物2由于含量較少沒有得到明確的結(jié)構(gòu)。
【圖文】：

圖 2.1 藿香花中內(nèi)生真菌的顯微結(jié)構(gòu)圖注：(a)-絲核菌菌絲 (b)-黑孢霉菌分生孢子頭 (c)-長蠕孢菌分生孢子 (d)-短蠕孢菌分生孢子與菌絲 (e)-絲孢菌菌絲 (f)-鏈格孢菌分生孢子與分生孢子梗 (g)-鐮刀菌屬分生孢子與分生孢子梗 (h)-頭霉孢菌孢子與分生孢子梗運(yùn)用植物組織平板分離法對藿香花中內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，所得到的分離結(jié)果與表面消毒所用消毒劑的種類、消毒時(shí)間、培養(yǎng)基種類和組織塊的大小等因素等有密切的關(guān)系。例如，在植物中存在的內(nèi)生真菌并不能全部被分離純化出來，這是由于在植物體外不能完全模擬在宿主植物體內(nèi)相同或者相似的生態(tài)環(huán)境或者活性物質(zhì)，使原本在宿主生存的內(nèi)生真菌不能夠被分離出來。因此，要不斷改變培養(yǎng)基的種類以不斷適應(yīng)不同種類的內(nèi)生真菌對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，以獲得更多種類的內(nèi)生真菌。在分離過程中，先從植物組織塊上長出的內(nèi)生真菌不能在以后的純化過程中被分離得到，，這可能也是由于培養(yǎng)基中缺乏生長繁殖必須的營養(yǎng)物質(zhì)造成的。在對植物組織進(jìn)行表面消毒的過程中，消毒劑既能殺死植物組織表面的微生物，同時(shí)對植物組織的細(xì)胞也造成了一定的損傷，所以在實(shí)驗(yàn)過程中要根

菌株H-2的系統(tǒng)發(fā)育樹
【學(xué)位授予單位】：蘭州理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R915

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本文編號：2648500