【摘要】：研究背景肝癌是常見惡性腫瘤。2019年1月,國(guó)家癌癥中心發(fā)布最新一期統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,原發(fā)性肝癌位于我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病譜第四位,而病死率卻居全國(guó)第二位。與全球惡性腫瘤新發(fā)病例和死亡病例比較,我國(guó)肝癌等消化道腫瘤占到全球一半。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肝癌治療取得了很大進(jìn)步。但因肝癌早期臨床癥狀不顯著,70%~80%病人就診時(shí)病情已為進(jìn)展階段。目前,以外科手術(shù)、肝動(dòng)脈栓塞化療、放療以及聯(lián)合多種治療手段的綜合治療是我國(guó)專家推薦的治療方案。因此,若能抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,將顯著提高腫瘤治療效果,改善病人預(yù)后。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)于上世紀(jì)八十年代已被我國(guó)科學(xué)家用于急性早幼粒白血病的治療,取得了很好療效,在九十年代被譽(yù)為國(guó)際抗癌藥物三大發(fā)現(xiàn)之一,備受國(guó)內(nèi)外專家關(guān)注。而ATRA在用于肝癌治療時(shí)發(fā)現(xiàn),要產(chǎn)生療效,需要的藥物濃度是白血病治療的十倍。如此高的用藥濃度不適合臨床應(yīng)用,其原因是高劑量ATRA的應(yīng)用可引起維甲酸綜合癥。尋找低毒高效的維甲酸衍生物顯得尤為重要。在ATRA基礎(chǔ)上人工加上一個(gè)酰胺基團(tuán)而成N-(4-羥基苯基)維生素甲酰胺(fenretinide)為乳腺癌化學(xué)預(yù)防的藥物,其副作用較小。早期研究顯示它具有預(yù)防和治療腫瘤、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,近些年研究顯示其具有預(yù)防腫瘤血管生成和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。本文著重研究fenretinide對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移的影響。腫瘤的轉(zhuǎn)移與其運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)有密切關(guān)聯(lián),肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表達(dá)增加和激活是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的重要因素。Fenretinide抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用機(jī)制與降低細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性是否有關(guān)?尚不明確。目前,fenretinide抑制肝癌細(xì)胞遷移及其相關(guān)機(jī)制報(bào)道較少。本課題探討fenretinide對(duì)肝癌Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,是否能降低肝癌細(xì)胞的遷移,以及這種作用是否與MLCK有關(guān),并通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證它的有效性和相關(guān)機(jī)制。為fenretinide更好的用于肝癌的臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。目的體外研究fenretinide對(duì)肝癌細(xì)胞系Hep G2和SMMC-7721增殖、平板克隆形成和遷移能力的影響,體內(nèi)研究fenretinide對(duì)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721成瘤影響,并初步探討其作用機(jī)制。方法用不同濃度的fenretinide和前身藥物ATRA分別處理肝癌Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞,MTS法檢測(cè)藥物刺激后細(xì)胞的增殖能力;平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物作用后Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞體外克隆形成能力;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種藥物對(duì)Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響。為進(jìn)一步研究fenretinide和ATRA影響Hep G2、SMMC-7721細(xì)胞遷移的作用機(jī)制,Western blot檢測(cè)MLCK、p38-MAPK信號(hào)通路蛋白、遷移相關(guān)蛋白等的表達(dá)。Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞中分別和組合加入fenretinide、ATRA、SB203580、ML-7,以細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移變化,Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)變化。采用SMMC-7721細(xì)胞皮下移植裸小鼠獲得肝癌移植瘤模型,用藥后定期監(jiān)測(cè)腫瘤體積和小鼠體重,觀察藥物對(duì)移植瘤增長(zhǎng)的抑制作用,HE染色觀察對(duì)移植瘤病理形態(tài)的影響,Masson染色觀察對(duì)移植瘤纖維組織分布影響,免疫組化和Western blot檢測(cè)對(duì)移植瘤MLCK、MLC和p38-MAPK磷酸化的影響。結(jié)果Fenretinide能抑制Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖,在1μM~25μM濃度范圍內(nèi),fenretinide對(duì)Hep G2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為1.32%到95.13%;對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為0.27%到78.36%,作用的量效關(guān)系明顯。抑制作用的時(shí)效關(guān)系亦明顯,fenretinide 15μM處理Hep G2細(xì)胞48 h抑制率接近50%,處理72 h則達(dá)到90%;15μM處理SMMC-7721細(xì)胞48 h抑制率接近30%,處理72h則達(dá)到85%。同時(shí),fenretinide能顯著抑制Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞平板克隆形成和遷移能力。在相同藥物濃度作用下,ATRA對(duì)細(xì)胞增殖、平板克隆和遷移抑制效應(yīng)均弱于fenretinide。細(xì)胞蛋白水平檢測(cè)顯示fenretinide抑制了Hep G2細(xì)胞MLCK表達(dá)和MLC磷酸化,抑制了SMMC-7721細(xì)胞MLC磷酸化;并且改變了遷移相關(guān)蛋白E-cadherin和F-actin表達(dá);在信號(hào)通路上,fenretinide激活了p38-MAPK通路。加入了p38-MAPK通路的抑制劑,顯示SB203580會(huì)逆轉(zhuǎn)fenretinide對(duì)Hep G2細(xì)胞遷移的抑制作用;蛋白水平檢測(cè)顯示,MLC磷酸化增加,遷移相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)降低,F-actin表達(dá)增加,與fenretinide單獨(dú)作用效應(yīng)相反。進(jìn)一步觀察fenretinide是否通過(guò)降低MLCK活性減少Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞的遷移,使用MLCK抑制劑ML-7,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制,ML-7聯(lián)合fenretinide細(xì)胞遷移能力降低更顯著;蛋白水平檢測(cè)顯示,MLC磷酸化降低,p38磷酸化增加,遷移相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)增加,F-actin表達(dá)減少,與fenretinide單獨(dú)作用效應(yīng)相類同。體內(nèi)裸小鼠移植瘤模型觀察到fenretinide顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞移植瘤增殖,抑制能力隨藥物使用時(shí)間延長(zhǎng)而加強(qiáng),用藥期間小鼠體重沒(méi)有顯著下降;移植瘤組織鏡下可見細(xì)胞核排列相對(duì)規(guī)則,壞死較少見,纖維組織分布增加,MLCK磷酸化減少,p38-MAPK磷酸化增加。結(jié)論Fenretinide可以抑制Hep G2細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力;與ATRA比較,fenretinide更有效的抑制了Hep G2細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移作用;fenretinide激活p38-MAPK信號(hào)通路,改變遷移相關(guān)蛋白E-cadherin和F-actin表達(dá),下調(diào)MLCK活性從而降低細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性,抑制Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞的遷移。Fenretinide有效抑制了肝癌移植瘤增殖,改善了肝癌組織形態(tài)紊亂狀況,增加了纖維組織分布,作用可能與激活p38-MAPK通路,降低MLC磷酸化相關(guān)。
【圖文】：

圖 5 fenretinide 改變 HepG2 細(xì)胞形態(tài)度 fenretinide 或 ATRA 作用于 HepG2 細(xì)胞 48 h，用 Leica DMI3000B 倒置顯微態(tài)改變（放大 100 倍）Fig 5. The effect of fenretinide on the morphology of HepG2 cellsanges in cell morphology were observed when HepG2 cells were treated with trations of fenretinide or ATRA for 48 h, and cells were photographed using Leica DMcope (magnification, x100).enretinide 和 ATRA 作用 48 h，光鏡下觀察 SMMC-7721 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：對(duì)照和溶劑 DMSO 對(duì)照）如下圖 6，細(xì)胞生長(zhǎng)密集，光澤度好；5 μM 和inide 處理組（如下圖 6）細(xì)胞密度均較對(duì)照組明顯降低，生長(zhǎng)稀疏，，細(xì)胞核出現(xiàn)腫脹、破裂等，細(xì)胞失去貼壁生長(zhǎng)特性，高濃度組現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞液顏色亦有改變，光鏡下拍出的背景顏色區(qū)別較大。15 μM（如下圖 6）細(xì)胞亦有減少，無(wú)堆疊生長(zhǎng)，但形態(tài)改變不顯著，5 μM（如下圖 6）與對(duì)照組相比，形態(tài)和密度改變均不顯著。

圖 6 fenretinide 改變 SMMC-7721 細(xì)胞形態(tài)濃度 fenretinide 或 ATRA 作用于 SMMC-7721 細(xì)胞 48 h，用 Leica DMI3000B 倒置顯細(xì)胞形態(tài)改變（放大 100 倍）Fig 6. The effect of fenretinide on the morphology of SMMC-7721 cellse changes in cell morphology were observed when SMMC-7721 cells were treated with diffcentrations of fenretinide or ATRA for 48 h, and cells were photographed using Leica DMI3croscope (magnification, x100).3 Fenretinide 抑制 HepG2、SMMC-7721 細(xì)胞遷移細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示 fenretinide 以劑量依賴方式抑制 HepG2 細(xì)胞的遷移，如 7。24 h 遷移率分別為：5 μM，0.22±0.04，10 μM，0.19±0.05；48 h 遷移率分：5 μM，0.51±0.07，10 μM，0.32±0.01。而細(xì)胞對(duì)照組的遷移率 24 h 是 0.45±0 h 是 0.74±0.05。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示 fenretinide 在 24 h 和 48 h 可顯著抑制 HepG的遷移(p㩳0.05)，，如下圖 7B。ATRA 僅高濃度 10 μM 組有抑制 HepG2 細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭瓊波;;ATRA聯(lián)合三氧化二砷在急性早幼粒細(xì)胞白血病治療中的臨床應(yīng)用研究[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生;2011年20期

2 ;Down-Regulation of CD44 Contributes to the Differentiation of HL-60 Cells Induced by ATRA or HMBA[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年01期

3 賀鵬程;張梅;李靜;蔡瑞波;劉亞琳;曹云新;;Effects of varied interferons in combination with all-trans retinoic acid ( ATRA ) on proliferation and differentiation of ATRA-resistent APL cell[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2006年04期

4 黃梅,劉文勵(lì),李春蕊,鄧金牛,周劍鋒,張東華,孫漢英;The Effect of Sodium Butyrate in Combination with ATRA on the Proliferation/Differentiation of SKM-1[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2004年04期

5 譚立軍,李慧,易靜,湯雪明,沈忠英;EXPERIMENTAL STUDY ON DIMETHYLSULFOXIDEINDUCED DIFFERENTIATION OF HUMAN ESOPHAGEALEPITHELIAL CARCINOMA CELLS[J];Journal of Shanghai Second Medical University;1998年Z1期

6 林建樹 ,余英豪;全反視黃酸治療急性早幼粒白血病:初步結(jié)果[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);1993年03期

7 張揚(yáng);;三氧化二砷聯(lián)合全反式維甲酸治療急性早幼粒細(xì)胞白血病臨床療效觀察[J];深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志;2014年06期

8 徐莉敏;張登海;楊春欣;彭彬;曹帆帆;Geroges UZAN;;雷公藤紅素對(duì)ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化成熟的影響[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年03期

9 江海燕;但自力;王暉;林菊生;;Effect of ATRA on Contents of liver Retinoids, Oxidative Stress and Hepatic Injury in Rat Model of Extrahepatic Cholestasis[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2007年05期

10 潘志紅;但自力;付妤;唐望先;林菊生;;Low-dose ATRA Supplementation Abolishes PRM Formation in Rat Liver and Ameliorates Ethanol-induced Liver Injury[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2006年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉昱們;Hong Yuan;Fuqiang Hu;;Nuclear-Targeting Micelles of Pin1 Inhibitor ATRA Combat Breast Cancer Selectively and Effectively[A];2018年第十二屆中國(guó)藥物制劑大會(huì)論文集[C];2018年

2 Lianlian Li;Huijuan Zou;Guanhua Song;Xia Li;Yang Han;Qiong Liao;Jing Tian;Xiaoyu Zhang;Xia Ren;Qiang Guo;Huifang Ding;Guosheng Jiang;;Up-regulation of CD54 and down-regulation of HLA-ABC contribute to the enhanced susceptibility of HL60 cells to NK cell-mediated cytolysis induced by ATRA plus VPA[A];第十屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)匯編[C];2015年

3 Kun Yn;Mei han;Jinkun Wen;;ATRA activates and PDGF-BB represses the SM22α promoter through KLF4 binding to or dissociating from its cis-DNA elements[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議摘要集[C];2010年

4 Qian Zhou;Siyue Lou;Bo Yang;Qiaojun He;Meidan Ying;;SUMO-1 modification regulates ATRA-induced differentiation via stabilization of RARα[A];第八屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)暨第十三屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2014年

5 ;ATRA Supresses KLF4 Deacetylation Via Inhibiting Its Interaction with HDAC2 in VSMCs[A];2008年全國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2008年

6 Xia Zhan;Ji-hui Tang;Jin-fang Ge;Ting Mei;Fei-hu Chen;;Pharmacokinetics of a novel anti-tumor drug,4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate[A];安徽省藥理學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2012年

7 唐善浩;裴仁治;;全反式維甲酸治療急性早幼粒細(xì)胞白血病耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[A];2012年浙江省血液病學(xué)年會(huì)論文集[C];2012年

8 史建紅;鄭斌;陳斯;馬國(guó)艷;溫進(jìn)坤;;RRARalpha mediates All-trans retinoic Acid-induced KLF4 gene expression through interacting with KLF4,Sp1,and YB1 in vascular smooth muscle cells[A];生命的分子機(jī)器及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)——2012年全國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要集[C];2012年

9 Guanhua Song;Yanmei Li;Zhiyong Zhang;Xia Ren;Hongjiang Li;Wen Zhang;Guosheng Jiang;;c-Myc but not Hif-1α dependent down-regulation of VEGF induced by ATRA contribute to the differentiation of HL-60 cells[A];第八屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2012年

10 鄭培p

本文編號(hào)：2648439