【摘要】：研究背景肝癌是常見惡性腫瘤。2019年1月,國家癌癥中心發(fā)布最新一期統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,原發(fā)性肝癌位于我國惡性腫瘤發(fā)病譜第四位,而病死率卻居全國第二位。與全球惡性腫瘤新發(fā)病例和死亡病例比較,我國肝癌等消化道腫瘤占到全球一半。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肝癌治療取得了很大進步。但因肝癌早期臨床癥狀不顯著,70%~80%病人就診時病情已為進展階段。目前,以外科手術(shù)、肝動脈栓塞化療、放療以及聯(lián)合多種治療手段的綜合治療是我國專家推薦的治療方案。因此,若能抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移,將顯著提高腫瘤治療效果,改善病人預(yù)后。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)于上世紀八十年代已被我國科學(xué)家用于急性早幼粒白血病的治療,取得了很好療效,在九十年代被譽為國際抗癌藥物三大發(fā)現(xiàn)之一,備受國內(nèi)外專家關(guān)注。而ATRA在用于肝癌治療時發(fā)現(xiàn),要產(chǎn)生療效,需要的藥物濃度是白血病治療的十倍。如此高的用藥濃度不適合臨床應(yīng)用,其原因是高劑量ATRA的應(yīng)用可引起維甲酸綜合癥。尋找低毒高效的維甲酸衍生物顯得尤為重要。在ATRA基礎(chǔ)上人工加上一個酰胺基團而成N-(4-羥基苯基)維生素甲酰胺(fenretinide)為乳腺癌化學(xué)預(yù)防的藥物,其副作用較小。早期研究顯示它具有預(yù)防和治療腫瘤、促進腫瘤細胞凋亡的作用,近些年研究顯示其具有預(yù)防腫瘤血管生成和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。本文著重研究fenretinide對肝癌細胞增殖、遷移的影響。腫瘤的轉(zhuǎn)移與其運動性增強有密切關(guān)聯(lián),肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表達增加和激活是細胞運動的重要因素。Fenretinide抑制腫瘤細胞遷移的作用機制與降低細胞運動性是否有關(guān)?尚不明確。目前,fenretinide抑制肝癌細胞遷移及其相關(guān)機制報道較少。本課題探討fenretinide對肝癌Hep G2和SMMC-7721細胞生物學(xué)行為的影響,是否能降低肝癌細胞的遷移,以及這種作用是否與MLCK有關(guān),并通過動物體內(nèi)實驗進一步論證它的有效性和相關(guān)機制。為fenretinide更好的用于肝癌的臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。目的體外研究fenretinide對肝癌細胞系Hep G2和SMMC-7721增殖、平板克隆形成和遷移能力的影響,體內(nèi)研究fenretinide對肝癌細胞系SMMC-7721成瘤影響,并初步探討其作用機制。方法用不同濃度的fenretinide和前身藥物ATRA分別處理肝癌Hep G2和SMMC-7721細胞,MTS法檢測藥物刺激后細胞的增殖能力;平板克隆實驗檢測藥物作用后Hep G2和SMMC-7721細胞體外克隆形成能力;細胞劃痕實驗檢測兩種藥物對Hep G2和SMMC-7721細胞遷移能力的影響。為進一步研究fenretinide和ATRA影響Hep G2、SMMC-7721細胞遷移的作用機制,Western blot檢測MLCK、p38-MAPK信號通路蛋白、遷移相關(guān)蛋白等的表達。Hep G2和SMMC-7721細胞中分別和組合加入fenretinide、ATRA、SB203580、ML-7,以細胞劃痕檢測細胞遷移變化,Western blot檢測相關(guān)蛋白表達變化。采用SMMC-7721細胞皮下移植裸小鼠獲得肝癌移植瘤模型,用藥后定期監(jiān)測腫瘤體積和小鼠體重,觀察藥物對移植瘤增長的抑制作用,HE染色觀察對移植瘤病理形態(tài)的影響,Masson染色觀察對移植瘤纖維組織分布影響,免疫組化和Western blot檢測對移植瘤MLCK、MLC和p38-MAPK磷酸化的影響。結(jié)果Fenretinide能抑制Hep G2和SMMC-7721細胞的增殖,在1μM~25μM濃度范圍內(nèi),fenretinide對Hep G2細胞的生長抑制率為1.32%到95.13%;對SMMC-7721細胞生長抑制率為0.27%到78.36%,作用的量效關(guān)系明顯。抑制作用的時效關(guān)系亦明顯,fenretinide 15μM處理Hep G2細胞48 h抑制率接近50%,處理72 h則達到90%;15μM處理SMMC-7721細胞48 h抑制率接近30%,處理72h則達到85%。同時,fenretinide能顯著抑制Hep G2和SMMC-7721細胞平板克隆形成和遷移能力。在相同藥物濃度作用下,ATRA對細胞增殖、平板克隆和遷移抑制效應(yīng)均弱于fenretinide。細胞蛋白水平檢測顯示fenretinide抑制了Hep G2細胞MLCK表達和MLC磷酸化,抑制了SMMC-7721細胞MLC磷酸化;并且改變了遷移相關(guān)蛋白E-cadherin和F-actin表達;在信號通路上,fenretinide激活了p38-MAPK通路。加入了p38-MAPK通路的抑制劑,顯示SB203580會逆轉(zhuǎn)fenretinide對Hep G2細胞遷移的抑制作用;蛋白水平檢測顯示,MLC磷酸化增加,遷移相關(guān)蛋白E-cadherin表達降低,F-actin表達增加,與fenretinide單獨作用效應(yīng)相反。進一步觀察fenretinide是否通過降低MLCK活性減少Hep G2和SMMC-7721細胞的遷移,使用MLCK抑制劑ML-7,發(fā)現(xiàn)細胞的遷移能力明顯受到抑制,ML-7聯(lián)合fenretinide細胞遷移能力降低更顯著;蛋白水平檢測顯示,MLC磷酸化降低,p38磷酸化增加,遷移相關(guān)蛋白E-cadherin表達增加,F-actin表達減少,與fenretinide單獨作用效應(yīng)相類同。體內(nèi)裸小鼠移植瘤模型觀察到fenretinide顯著抑制SMMC-7721細胞移植瘤增殖,抑制能力隨藥物使用時間延長而加強,用藥期間小鼠體重沒有顯著下降;移植瘤組織鏡下可見細胞核排列相對規(guī)則,壞死較少見,纖維組織分布增加,MLCK磷酸化減少,p38-MAPK磷酸化增加。結(jié)論Fenretinide可以抑制Hep G2細胞和SMMC-7721細胞增殖、克隆形成和遷移能力;與ATRA比較,fenretinide更有效的抑制了Hep G2細胞和SMMC-7721細胞增殖、克隆形成和遷移作用;fenretinide激活p38-MAPK信號通路,改變遷移相關(guān)蛋白E-cadherin和F-actin表達,下調(diào)MLCK活性從而降低細胞運動性,抑制Hep G2和SMMC-7721細胞的遷移。Fenretinide有效抑制了肝癌移植瘤增殖,改善了肝癌組織形態(tài)紊亂狀況,增加了纖維組織分布,作用可能與激活p38-MAPK通路,降低MLC磷酸化相關(guān)。
【圖文】：

圖 5 fenretinide 改變 HepG2 細胞形態(tài)度 fenretinide 或 ATRA 作用于 HepG2 細胞 48 h，用 Leica DMI3000B 倒置顯微態(tài)改變（放大 100 倍）Fig 5. The effect of fenretinide on the morphology of HepG2 cellsanges in cell morphology were observed when HepG2 cells were treated with trations of fenretinide or ATRA for 48 h, and cells were photographed using Leica DMcope (magnification, x100).enretinide 和 ATRA 作用 48 h，光鏡下觀察 SMMC-7721 細胞發(fā)現(xiàn)：對照和溶劑 DMSO 對照）如下圖 6，細胞生長密集，光澤度好；5 μM 和inide 處理組（如下圖 6）細胞密度均較對照組明顯降低，生長稀疏，，細胞核出現(xiàn)腫脹、破裂等，細胞失去貼壁生長特性，高濃度組現(xiàn)時，細胞液顏色亦有改變，光鏡下拍出的背景顏色區(qū)別較大。15 μM（如下圖 6）細胞亦有減少，無堆疊生長，但形態(tài)改變不顯著，5 μM（如下圖 6）與對照組相比，形態(tài)和密度改變均不顯著。

圖 6 fenretinide 改變 SMMC-7721 細胞形態(tài)濃度 fenretinide 或 ATRA 作用于 SMMC-7721 細胞 48 h，用 Leica DMI3000B 倒置顯細胞形態(tài)改變（放大 100 倍）Fig 6. The effect of fenretinide on the morphology of SMMC-7721 cellse changes in cell morphology were observed when SMMC-7721 cells were treated with diffcentrations of fenretinide or ATRA for 48 h, and cells were photographed using Leica DMI3croscope (magnification, x100).3 Fenretinide 抑制 HepG2、SMMC-7721 細胞遷移細胞劃痕實驗顯示 fenretinide 以劑量依賴方式抑制 HepG2 細胞的遷移，如 7。24 h 遷移率分別為：5 μM，0.22±0.04，10 μM，0.19±0.05；48 h 遷移率分：5 μM，0.51±0.07，10 μM，0.32±0.01。而細胞對照組的遷移率 24 h 是 0.45±0 h 是 0.74±0.05。統(tǒng)計結(jié)果顯示 fenretinide 在 24 h 和 48 h 可顯著抑制 HepG的遷移(p㩳0.05)，，如下圖 7B。ATRA 僅高濃度 10 μM 組有抑制 HepG2 細胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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10 鄭培p

本文編號：2648439