【摘要】：表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor,EGF)是由53個(gè)氨基酸組成的多肽,分子量為6054 Da。EGF作用廣泛,其不僅能夠促使表皮細(xì)胞增殖和分化,在角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移方面也有促進(jìn)作用,從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的增殖。因此,EGF在傷口愈合、加速損傷修復(fù)以及器官形成中發(fā)揮了巨大的作用。它還廣泛用于各種化妝品中,因?yàn)樗梢源龠M(jìn)透明質(zhì)酸,糖蛋白等的合成和分泌,并活化皮膚的基底細(xì)胞。隨著對(duì)EGF研究的不斷深入,其特殊的生物學(xué)效應(yīng)被不斷挖掘,成為近幾年來(lái)研究的熱點(diǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)使用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)中表達(dá)載體都是整合載體,其中pGAP系列與其他整合載體相比優(yōu)勢(shì)更為突出。首先,使用pGAP系統(tǒng)發(fā)酵時(shí)不需要添加甲醇,一方面可以節(jié)省甲醇的運(yùn)輸成本,另一方面也可以避免甲醇因易燃易爆帶來(lái)的潛在危險(xiǎn)。其次,發(fā)酵過(guò)程中不需要更換碳源,可以減少雜菌的污染,此外,pGAP表達(dá)系統(tǒng)采用連續(xù)發(fā)酵的方式,發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單而且周期短,大大提高了生產(chǎn)效率,更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究的目的是利用三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(pGAP)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)組成型表達(dá)EGF,并對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。本研究首先以畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA為基礎(chǔ),根據(jù)酵母細(xì)胞密碼子偏好性優(yōu)化EGF基因序列并合成,在序列兩端引入Xhol I和Eco R I位點(diǎn),為方便純化在目的基因前引入6×HIS,為實(shí)現(xiàn)蛋白的高效表達(dá),選取融合標(biāo)簽-Asn-Gly,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGAPZαA-6His-Asn-Gly-EGF。測(cè)序正確后,線性化電轉(zhuǎn)至畢赤酵母感受態(tài)GS115。通過(guò)Zeocin抗性培養(yǎng)基和PCR鑒定篩選出成功整合到酵母基因組的工程菌,采用搖瓶培養(yǎng),經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析,獲得了高表達(dá)重組蛋白的工程菌。本研究還對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了探索,采用單因素實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化發(fā)酵條件:最佳碳源,最佳pH值,最佳碳源濃度,最佳發(fā)酵溫度,發(fā)酵時(shí)間和接種濃度。并采用Ni-Sepharose 6FF親和層析柱純化重組蛋白,用Bradford法檢測(cè)EGF的分泌濃度。最后測(cè)定了經(jīng)羥胺切割后的重組蛋白對(duì)Balb/c 3T3細(xì)胞的增殖活性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):高表達(dá)菌株在72 h具有最高的蛋白質(zhì)表達(dá),為0.05mg/mL。發(fā)酵條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化得出:最佳碳源為甘油、其濃度為2.5%、發(fā)酵時(shí)間為72 h、接種量為2.0%、pH為6.0、溫度為30℃。發(fā)酵液上清通過(guò)Ni-Sepharose 6FF柱成功獲得了純化的重組蛋白。生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組蛋白經(jīng)羥胺切割后能夠以劑量依賴的方式有效促進(jìn)Balb/c 3T3細(xì)胞的增殖,具有良好的生物活性。
【圖文】：

EGF的結(jié)構(gòu)

圖 1.2 pGAPZ 系列表達(dá)載體Sears 等[64]將 pGAP 基因亞克隆到載體 pIB1 中以獲得 pIB2，并將β-葡糖醛酸糖苷酶基因克隆到 pIB2 中。經(jīng)線性轉(zhuǎn)化后，在畢赤酵母中β-葡糖醛酸糖苷酶得以成功表達(dá)。張平濤[65]也組成型表達(dá)羧肽酶 B（CPB），他是以 pIB2 為模板擴(kuò)增pGAP 基因片段。在質(zhì)粒 pPIC9K-proCPB 上取代 pAOX1 構(gòu)建組成型表達(dá)載體pGAP9K-proCPB。pGAP表達(dá)系統(tǒng)可以使用多種碳源，例如油酸，甘油，葡萄糖和甲醇。但是哪種碳源是最佳的仍然有待研究。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中僅含有甲醇時(shí)，蛋白的表達(dá)最低[63]。一般情況下，畢赤酵母pGAP表達(dá)系統(tǒng)常用的碳源為葡萄糖和甘油，但在搖瓶表達(dá)時(shí)以葡萄糖為唯一碳源[66-67]，，而在高密度發(fā)酵水平則用甘油[68-69]。由于pGAP不需要甲醇誘導(dǎo)，所以不存在安全和環(huán)境污染的問(wèn)題，并且發(fā)酵過(guò)程更安全，這為目的蛋白的工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)提供了有利的條件。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R945

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本文編號(hào)：2648317