【摘要】：研究背景:類風濕性關(guān)節(jié)炎是以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的一種自身免疫性疾病。糖皮質(zhì)激素是《類風濕性關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南》推薦使用的治療藥物,但是長期、大劑量使用會產(chǎn)生免疫抑制、骨質(zhì)疏松等嚴重副作用。我們課題組前期研究顯示,七葉皂苷能夠增強低劑量糖皮質(zhì)激素的抗關(guān)節(jié)炎作用,但是詳細作用機制不清,有待進一步闡明。研究意義:明確七葉皂苷與糖皮質(zhì)激素聯(lián)用對類風濕性關(guān)節(jié)炎的保護作用及其機制,為臨床聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。研究方法:一、體內(nèi)實驗:制備SD大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型,隨機分為模型組(AIA)、地塞米松高劑量(DEX,0.2 mg/kg)組、地塞米松低劑量(DEX,0.05 mg/kg)組、七葉皂苷(ESCIN,10 mg/kg)組、地塞米松低劑量+七葉皂苷(DEX 0.05+ESCIN)組,每組10只,另取10只同背景SD大鼠作為正常對照(Control)組。造模成功后各組灌胃(ig.)給予相應(yīng)藥物或溶媒,1次/d,連續(xù)14 d。1.足腫脹及病理檢測:造模前后每隔3 d用足跖容積測量儀檢測大鼠后肢原發(fā)側(cè)與繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹變化;蘇木精和伊紅(H-E)染色觀察足跖病理變化。2.炎癥因子檢測:Elisa法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6炎癥因子。3.免疫器官病理檢測:取脾臟、胸腺稱重,計算免疫器官指數(shù);并通過H-E染色觀察病理變化;4.糖皮質(zhì)激素受體(GR)及其下游炎癥通路檢測:基因芯片檢測大鼠繼發(fā)側(cè)腫脹關(guān)節(jié)滑膜組織GR信號通路基因表達;Western blot檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜GR、核因子κB p65(NF-κB p65)、IκB-α以及磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白表達。二、體外實驗:用LPS刺激小鼠RAW 264.7巨噬細胞制備炎癥模型,分為Control組、LPS組、DEX高劑量(50 n M)組、DEX低劑量(12.5 n M)組、ESCIN 10μM組、DEX+ESCIN(12.5 n M+10μM)組,每孔加入相應(yīng)藥物,培養(yǎng)2 h后加入LPS 2μl(終濃度1μg/m L)致炎。1.炎癥因子檢測:LPS作用24 h后Griess法檢測細胞上清NO表達;作用6 h后Elisa法測定細胞上清TNF-α、IL-6炎癥因子濃度;2.GR及其下游炎癥通路檢測:LPS作用1 h后,RT-PCR檢測GR m RNA表達;作用6 h后Western blot檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜GR、p65、IκB-α以及磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白水平。結(jié)果:一、體內(nèi)實驗結(jié)果:1.對關(guān)節(jié)腫脹影響:與Control組相比,AIA組大鼠原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹率及關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)明顯升高(P0.01),關(guān)節(jié)組織出現(xiàn)滑膜增生與軟骨破壞;與AIA組相比,DEX高劑量和DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥均顯著抑制大鼠關(guān)節(jié)腫脹率及關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)(P0.01),關(guān)節(jié)滑膜增生與軟骨破壞亦明顯減輕;與DEX低劑量組相比,DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥對關(guān)節(jié)腫脹率及關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)抑制效果增強,關(guān)節(jié)破壞減輕。2.對炎癥因子影響:與Control組相比,AIA組大鼠血清TNF-α及IL-6含量顯著升高(P0.01);與AIA組相比,DEX高劑量和DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥可顯著降低血清TNF-α及IL-6含量(P0.01);與DEX低劑量組相比,DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥對血清TNF-α及IL-6炎癥因子抑制作用增強。3.對免疫器官的影響:與Control組相比,AIA組大鼠胸腺無明顯萎縮,脾臟略有增大;DEX高劑量組大鼠脾臟、胸腺嚴重萎縮(P0.01),脾臟淋巴小結(jié)數(shù)量明顯減少,胸腺皮質(zhì)變薄,胸腺細胞數(shù)量明顯減少,細胞胞漿內(nèi)有空泡形成;與DEX高劑量組相比,DEX低劑量+ESCIN組大鼠脾臟與胸腺萎縮明顯減輕。4.對GR及其下游炎癥通路影響:與Control組相比,AIA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織GR(Nr3c1)基因表達明顯下調(diào)(P0.01),TNF-α及IL-6基因表達明顯上調(diào)(P0.01);與AIA組和單用DEX組相比,DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Nr3c1基因表達明顯上調(diào)(P0.01);與Control組相比,AIA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織GR蛋白表達明顯降低(P0.05),p65及磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白表達明顯升高(P0.05);與AIA組相比,DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織GR蛋白表達明顯升高(P0.05),p65及磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白表達明顯降低(P0.05)。二、體外實驗結(jié)果:1.對炎癥因子影響:與Control組相比,LPS可刺激RAW 264.7巨噬細胞大量釋放炎癥因子NO、TNF-α與IL-6(P0.01);與LPS組相比,DEX低劑量+ESCIN可顯著抑制NO、TNF-α與IL-6的產(chǎn)生(P0.01);與DEX低劑量組相比,DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥可增強對TNF-α及IL-6的抑制作用。2.對GR及其下游炎癥通路影響:與Control組相比,給予LPS刺激可導致RAW 264.7巨噬細胞GR m RNA及蛋白表達明顯降低(P0.05),磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白水平明顯升高(P0.05);與LPS組相比,DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥可顯著提高GR m RNA及蛋白表達(P0.05),抑制磷酸化p65、磷酸化IκB-α蛋白表達(P0.05);但與單用DEX相比,聯(lián)合用藥GR m RNA及蛋白表達有一定提高;進一步阻斷GR后,發(fā)現(xiàn)DEX低劑量+ESCIN聯(lián)合用藥對炎癥通路磷酸化p65與磷酸化IκB-α蛋白的抑制作用明顯減弱。結(jié)論:七葉皂苷能夠增強低劑量糖皮質(zhì)激素的抗關(guān)節(jié)炎作用,降低糖皮質(zhì)激素的副作用,其作用機制可能與上調(diào)GR信號通路有關(guān)。
【學位授予單位】：煙臺大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R965

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本文編號：2647910