【摘要】：表觀遺傳學研究的是在DNA序列沒有改變的情況下,由染色體變化引起的可遺傳的表型變化。常見的染色體變化有DNA修飾、RNA修飾與組蛋白修飾等。組蛋白修飾是調節(jié)轉錄調控中重要的一部分。本文研究對象組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1是第一個被確定的組蛋白去甲基化酶,可以特異性地去除組蛋白H3K4和H3K9單雙甲基。據(jù)報道,LSD1在多種癌癥中過表達,如胃癌和白血病。LSD1功能的抑制可以降低癌細胞的增殖和轉移能力,因此獲取高效靶向LSD1抑制劑將成為癌癥治療新策略。目前LSD1抑制劑篩選方法較為有限,多為檢測抑制劑對LSD1抑制活性,在檢測抑制劑對LSD1靶向結合能力方面略有不足。且一些實驗方法例如基于H_2O_2定量的方法,無法評價與H_2O_2反應的化合物,具有一定局限性。因此建立多角度篩選方法可彌補篩選的局限性。待使用建立的篩選方法篩選得到分子水平活性較好的抑制劑后,對抑制劑進行進一步細胞水平抗腫瘤活性研究,為LSD1抑制劑進一步設計與優(yōu)化提供新思路。本課題圍繞以下問題開展:(1)LSD1截斷體重組蛋白的表達與純化本課題使用親和層析法與離子交換色譜柱法對LSD1截斷體重組蛋白進行純化,獲得純度95%的LSD1截斷體重組蛋白,可滿足后期抑制劑篩選與酶動力學研究需求。(2)LSD1抑制劑篩選方法建立本課題從化合物對酶抑制活性檢測、化合物與靶標結合以及酶-配體動力學三個角度進行了LSD1抑制劑篩選方法建立的實驗設計。課題首先表達并純化了甲醛脫氫酶,通過定量甲醛從而定量了LSD1去甲基化活性及小分子抑制劑對LSD1活性的抑制能力;其次使用染料SYPRO Orange實時監(jiān)測熒光值,反應化合物與蛋白的結合;最后本課題應用表面等離子共振技術實現(xiàn)了對抑制劑的篩選并獲得相應酶動力學數(shù)據(jù),彌補了現(xiàn)有LSD1抑制劑篩選方法無法評價抑制劑對LSD1靶向結合動力學的不足。(3)新型LSD1抑制劑抗腫瘤活性的研究本課題組通過對組內化合物庫的篩選與優(yōu)化,得到一個二苯乙烯類、一個吲哚衍生物類及兩個三唑并嘧啶類共四個高效LSD1靶向抑制劑,并在分子水平和細胞水平進行了活性評價。新型二苯乙烯類LSD1抑制劑DYC-8c在分子水平通過FAD競爭的方式可逆地抑制LSD1活性,所得IC_(50)=0.28μM,且以快結合(Kon=1.82×10~3 1/(M?s))、慢解離(Koff=1.00×10~-22 1/s)的方式作用于LSD1。在細胞水平,DYC-8c促進白血病THP-1細胞白細胞分化抗原CD86的表達并促進其髓樣分化,抑制其增殖與克隆形成能力,IC_(50)為5.76μM。此外,它還能使THP-1細胞中LSD1底物H3K4me2的累積逐漸增加,說明其在細胞內同樣靶向抑制LSD1的活性。新型不可逆吲哚衍生物類LSD1抑制劑XHW-9e為首個非單胺氧化酶抑制劑類的不可逆LSD1抑制劑,分子水平對LSD1 IC_(50)=1.23μM,并提高LSD1的穩(wěn)定性,說明其有效地靶向LSD1重組蛋白,且同樣以快結合(Kon=2.98×10~31/(M?s))、慢解離(Koff=6.05×10~(-2)1/s)的方式靶向作用于LSD1。細胞水平,XHW-9e可有效抑制THP-1的增殖與克隆形成能力,增殖抑制IC_(50)為1.20μM,促進了CD86的表達,促進了髓樣分化。新型三唑并嘧啶類LSD1抑制劑WS-996以可逆的形式通過競爭FAD從而抑制LSD1蛋白活性,IC_(50)=34.45 nM。在THP-1中可達到IC_(50)=1.65μM的細胞增殖抑制作用,促進THP-1的分化,有效提升細胞內LSD1熱穩(wěn)定性,說明其靶向細胞內LSD1并發(fā)揮作用。新型三唑并嘧啶類LSD1抑制劑WS-812與WS-996相比,具有相似的分子水平活性抑制能力與作用方式,IC_(50)=38.15 nM,K_D=6.23μM。此外,WS-812不僅對白血病THP-1細胞具有細胞增殖、克隆形成的抑制作用與促分化作用,而且可以較好地抑制胃癌細胞MGC-803的細胞增殖,有效抑制其克隆形成與轉移能力。綜上所述,本課題首次使用兩步法得到高純度LSD1重組蛋白,并首次根據(jù)副產物定量、蛋白熱穩(wěn)定性與表面等離子共振原理建立了三個LSD1抑制劑篩選方法,發(fā)現(xiàn)了四個新型LSD1抑制劑,其中三個為可逆抑制劑,一個為首個非單胺氧化酶抑制劑類的不可逆抑制劑。后期的抑制劑生物活性評價結果揭示了抑制劑的抗腫瘤活性,為新型靶向LSD1抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了重要的依據(jù)。
【圖文】：

圖 1.1 核小體“串珠模型”結構NA 修飾A 的主要修飾為 DNA 甲基化。在真核細胞中，DNA 的 CpG CpGIs）二核苷酸胞嘧啶在合成后被 DNA 甲基轉移酶ansferase，，DNMT）將 S-甲硫腺苷（S-adenosylmethionine，SA胞嘧啶的 C5 位置，轉化為 5-甲基胞嘧啶（5-methycytosine，5修飾[11]（圖 1.2）。DNA 的甲基化可以抑制轉錄因子與 DNA 募具有抑制基因表達功能的酶，從而造成基因沉默[12]。因此 D組關鍵的表觀遺傳修飾，參與許多細胞過程，包括基因轉錄、胚失活、染色體穩(wěn)定和基因組印記等[13]。

圖 1.1 核小體“串珠模型”結構修飾為 DNA 甲基化。在真核細胞中，DNA 二核苷酸胞嘧啶在合成后被 DNA 甲基，DNMT）將 S-甲硫腺苷（S-adenosylmethion的 C5 位置，轉化為 5-甲基胞嘧啶（5-methycy（圖 1.2）。DNA 的甲基化可以抑制轉錄因子與抑制基因表達功能的酶，從而造成基因沉默[12]的表觀遺傳修飾，參與許多細胞過程，包括基因染色體穩(wěn)定和基因組印記等[13]。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R91;R96

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 計超;席思維;張磊;于悅;吳曉煬;姜虹;;七氟烷下調LSD1表達抑制胚胎干細胞的自我更新[J];外科理論與實踐;2017年04期

2 李航;張勁帆;陳宇;盧靖宇;陳昱;;LSD1在乳腺癌中的表達及意義[J];莆田學院學報;2016年05期

3 周鑫鑫;周寧;劉長春;;LSD1小分子抑制劑的合成及抗腫瘤活性研究[J];化學試劑;2017年08期

4 吳紅梅;楊洋;;LSD1與E-鈣黏蛋白在胃癌中的表達及預后意義[J];檢驗醫(yī)學與臨床;2017年08期

5 石昌杰;花秋紅;張麗紅;張儒;;神經(jīng)干細胞特異性LSD1基因敲除對小鼠情緒及記憶的影響[J];中國實驗動物學報;2017年01期

6 林樂千;王偉;郝敏;;LSD1在婦科惡性腫瘤中的研究進展[J];國際婦產科學雜志;2017年04期

7 顧晨文;劉現(xiàn)立;;LSD1在人直腸腺癌組織中高表達[J];基礎醫(yī)學與臨床;2019年01期

8 曹冰雁;劉藝潔;武莉莉;費喬曼;楊冰;張玲;喬衛(wèi);;木蘭花堿減輕慢性應激小鼠抑郁樣行為及對腦部LSD1組蛋白修飾的影響[J];天津醫(yī)藥;2019年04期

9 劉秀雯;魏野;李袁霞;薛晶;萬曉蕾;金潔;邵根寶;;沉默LSD1基因的表達可抑制卵巢癌HO8910細胞的增殖并誘導其凋亡[J];腫瘤;2016年05期

10 林秀梅;曾麗華;許世林;王順清;毛平;;shRNA下調LSD1基因表達對人急性髓系白血病細胞凋亡與細胞周期的影響[J];實用醫(yī)學雜志;2017年03期

相關會議論文 前9條

1 張元元;汪曉鶯;張潔;;LSD1在結腸癌中的表達及其對結腸癌LoVo細胞遷移侵襲的影響[A];第九屆全國免疫學學術大會論文集[C];2014年

2 陳果;徐勇;;SET7/9和LSD1在2型糖尿病大血管病變中的作用——表觀機制探討[A];中華醫(yī)學會第十次全國內分泌學學術會議論文匯編[C];2011年

3 陶厚權;葉再元;王元宇;王惠菊;何徐軍;馬英玉;夏英捷;;LSD1在胃癌中的表達及其意義[A];2009年浙江省外科學學術年會論文匯編[C];2009年

4 林秀梅;鐘文婷;王順清;;組蛋白去甲基化酶LSD1在急性白血病的表達及其臨床意義[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

5 趙瀛蘭;;新型LSD1抑制劑抗腫瘤作用及機制研究[A];第十四屆中國藥學會青年藥學論壇報告集[C];2018年

6 王志茹;李金鳳;鄭一超;馬金蓮;趙文;劉宏民;;胃癌細胞中組蛋白去甲基化酶LSD1對TGF-β1表達的調控[A];2014年中國藥學大會暨第十四屆中國藥師周論文集[C];2014年

7 王世恩;劉鈺妮;楊建林;王艷林;曹春雨;;優(yōu)降寧通過抑制LSD1與奧沙利鉑協(xié)同抑制MDA-MB-231細胞增殖[A];中國生物化學與分子生物學會第十二屆全國會員代表大會暨2018年全國學術會議摘要集[C];2018年

8 鐘雯婷;王順清;毛平;;RYBP、BMI1及LSD1蛋白在急性白血病中表達情況的研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

9 全軍民;汪靜;盧菲;任騏;葉濤;張慧;;腫瘤干細胞特異性靶標的發(fā)現(xiàn)及小分子抑制劑的研究[A];中國化學會第28屆學術年會第3分會場摘要集[C];2012年

相關博士學位論文 前10條

1 張潔;LSD1對斑馬魚發(fā)育的影響及其機制的初步研究[D];復旦大學;2009年

2 王敏;LSD1介導前列腺癌侵襲、轉移的機制研究[D];武漢大學;2016年

3 丁杰;LSD1對結腸癌侵襲轉移能力的影響及其機制的研究[D];中南大學;2013年

4 胡鑫;LSD1表觀遺傳修飾對TAL1功能和機體造血調控機制的研究[D];吉林大學;2009年

5 譚理;組蛋白脫甲基酶LSD1在小鼠胚胎干細胞分化及斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用[D];復旦大學;2009年

6 雷增杰;組蛋白去甲基化酶LSD1促進腫瘤細胞“干性”和侵襲轉移的機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

7 陳德紅;LSD1在前列腺癌雄激素非依賴性表型轉化中的作用及機制研究[D];華中科技大學;2014年

8 陳聰;中藥單體槲皮素通過抑制LSD1干預上皮性卵巢癌侵襲的機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2017年

9 郭藝迪;LSD1介導的表觀遺傳修飾調控GATA Switch的機制研究[D];吉林大學;2016年

10 劉爽;1.轉錄因子RUNX1與KLF4相互作用及轉錄調控對t（8；21）白血病細胞生物學功能的影響 2.新型LSD1抑制劑JL1037的抗白血病作用及其機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2017年

相關碩士學位論文 前10條

1 索鳳至;LSD1小分子抑制劑篩選方法的建立及其抑制劑的篩選和抗腫瘤活性研究[D];鄭州大學;2019年

2 吳嫣然;2',3'-二氫螺[環(huán)丙烷-1,1'-茚]-2-胺類LSD1抑制劑的合成與構效關系研究[D];華東師范大學;2017年

3 盧太亮;LSD1在胃癌組織中的表達及意義[D];中南大學;2014年

4 高鴻;LSD1與腎透明細胞癌相關性的初步研究[D];南昌大學;2013年

5 馮杰鑫;組蛋白去甲基化酶LSD1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中作用及機制的初步研究[D];福建醫(yī)科大學;2017年

6 張聰哲;LSD1介導的組蛋白H3K4去甲基化對雄激素受體調控靶基因轉錄的影響[D];復旦大學;2013年

7 李丹丹;LSD1對T細胞及NK細胞表型的影響[D];天津醫(yī)科大學;2015年

8 李袁霞;LSD1介導的表觀遺傳學修飾促進卵巢癌細胞的遷移及侵襲[D];江蘇大學;2016年

9 陳果;SET7/9和LSD1在2型糖尿病大血管病變中的作用[D];瀘州醫(yī)學院;2011年

10 孫昊;LSD1在小鼠胚胎成纖維細胞重編程中的功能研究[D];北京林業(yè)大學;2013年

本文編號：2647400