【摘要】：表觀遺傳學(xué)研究的是在DNA序列沒有改變的情況下,由染色體變化引起的可遺傳的表型變化。常見的染色體變化有DNA修飾、RNA修飾與組蛋白修飾等。組蛋白修飾是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)控中重要的一部分。本文研究對象組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1是第一個(gè)被確定的組蛋白去甲基化酶,可以特異性地去除組蛋白H3K4和H3K9單雙甲基。據(jù)報(bào)道,LSD1在多種癌癥中過表達(dá),如胃癌和白血病。LSD1功能的抑制可以降低癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力,因此獲取高效靶向LSD1抑制劑將成為癌癥治療新策略。目前LSD1抑制劑篩選方法較為有限,多為檢測抑制劑對LSD1抑制活性,在檢測抑制劑對LSD1靶向結(jié)合能力方面略有不足。且一些實(shí)驗(yàn)方法例如基于H_2O_2定量的方法,無法評價(jià)與H_2O_2反應(yīng)的化合物,具有一定局限性。因此建立多角度篩選方法可彌補(bǔ)篩選的局限性。待使用建立的篩選方法篩選得到分子水平活性較好的抑制劑后,對抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)胞水平抗腫瘤活性研究,為LSD1抑制劑進(jìn)一步設(shè)計(jì)與優(yōu)化提供新思路。本課題圍繞以下問題開展:(1)LSD1截?cái)囿w重組蛋白的表達(dá)與純化本課題使用親和層析法與離子交換色譜柱法對LSD1截?cái)囿w重組蛋白進(jìn)行純化,獲得純度95%的LSD1截?cái)囿w重組蛋白,可滿足后期抑制劑篩選與酶動力學(xué)研究需求。(2)LSD1抑制劑篩選方法建立本課題從化合物對酶抑制活性檢測、化合物與靶標(biāo)結(jié)合以及酶-配體動力學(xué)三個(gè)角度進(jìn)行了LSD1抑制劑篩選方法建立的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。課題首先表達(dá)并純化了甲醛脫氫酶,通過定量甲醛從而定量了LSD1去甲基化活性及小分子抑制劑對LSD1活性的抑制能力;其次使用染料SYPRO Orange實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光值,反應(yīng)化合物與蛋白的結(jié)合;最后本課題應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對抑制劑的篩選并獲得相應(yīng)酶動力學(xué)數(shù)據(jù),彌補(bǔ)了現(xiàn)有LSD1抑制劑篩選方法無法評價(jià)抑制劑對LSD1靶向結(jié)合動力學(xué)的不足。(3)新型LSD1抑制劑抗腫瘤活性的研究本課題組通過對組內(nèi)化合物庫的篩選與優(yōu)化,得到一個(gè)二苯乙烯類、一個(gè)吲哚衍生物類及兩個(gè)三唑并嘧啶類共四個(gè)高效LSD1靶向抑制劑,并在分子水平和細(xì)胞水平進(jìn)行了活性評價(jià)。新型二苯乙烯類LSD1抑制劑DYC-8c在分子水平通過FAD競爭的方式可逆地抑制LSD1活性,所得IC_(50)=0.28μM,且以快結(jié)合(Kon=1.82×10~3 1/(M?s))、慢解離(Koff=1.00×10~-22 1/s)的方式作用于LSD1。在細(xì)胞水平,DYC-8c促進(jìn)白血病THP-1細(xì)胞白細(xì)胞分化抗原CD86的表達(dá)并促進(jìn)其髓樣分化,抑制其增殖與克隆形成能力,IC_(50)為5.76μM。此外,它還能使THP-1細(xì)胞中LSD1底物H3K4me2的累積逐漸增加,說明其在細(xì)胞內(nèi)同樣靶向抑制LSD1的活性。新型不可逆吲哚衍生物類LSD1抑制劑XHW-9e為首個(gè)非單胺氧化酶抑制劑類的不可逆LSD1抑制劑,分子水平對LSD1 IC_(50)=1.23μM,并提高LSD1的穩(wěn)定性,說明其有效地靶向LSD1重組蛋白,且同樣以快結(jié)合(Kon=2.98×10~31/(M?s))、慢解離(Koff=6.05×10~(-2)1/s)的方式靶向作用于LSD1。細(xì)胞水平,XHW-9e可有效抑制THP-1的增殖與克隆形成能力,增殖抑制IC_(50)為1.20μM,促進(jìn)了CD86的表達(dá),促進(jìn)了髓樣分化。新型三唑并嘧啶類LSD1抑制劑WS-996以可逆的形式通過競爭FAD從而抑制LSD1蛋白活性,IC_(50)=34.45 nM。在THP-1中可達(dá)到IC_(50)=1.65μM的細(xì)胞增殖抑制作用,促進(jìn)THP-1的分化,有效提升細(xì)胞內(nèi)LSD1熱穩(wěn)定性,說明其靶向細(xì)胞內(nèi)LSD1并發(fā)揮作用。新型三唑并嘧啶類LSD1抑制劑WS-812與WS-996相比,具有相似的分子水平活性抑制能力與作用方式,IC_(50)=38.15 nM,K_D=6.23μM。此外,WS-812不僅對白血病THP-1細(xì)胞具有細(xì)胞增殖、克隆形成的抑制作用與促分化作用,而且可以較好地抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的細(xì)胞增殖,有效抑制其克隆形成與轉(zhuǎn)移能力。綜上所述,本課題首次使用兩步法得到高純度LSD1重組蛋白,并首次根據(jù)副產(chǎn)物定量、蛋白熱穩(wěn)定性與表面等離子共振原理建立了三個(gè)LSD1抑制劑篩選方法,發(fā)現(xiàn)了四個(gè)新型LSD1抑制劑,其中三個(gè)為可逆抑制劑,一個(gè)為首個(gè)非單胺氧化酶抑制劑類的不可逆抑制劑。后期的抑制劑生物活性評價(jià)結(jié)果揭示了抑制劑的抗腫瘤活性,為新型靶向LSD1抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了重要的依據(jù)。
【圖文】：

圖 1.1 核小體“串珠模型”結(jié)構(gòu)NA 修飾A 的主要修飾為 DNA 甲基化。在真核細(xì)胞中，DNA 的 CpG CpGIs）二核苷酸胞嘧啶在合成后被 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶ansferase，，DNMT）將 S-甲硫腺苷（S-adenosylmethionine，SA胞嘧啶的 C5 位置，轉(zhuǎn)化為 5-甲基胞嘧啶（5-methycytosine，5修飾[11]（圖 1.2）。DNA 的甲基化可以抑制轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 募具有抑制基因表達(dá)功能的酶，從而造成基因沉默[12]。因此 D組關(guān)鍵的表觀遺傳修飾，參與許多細(xì)胞過程，包括基因轉(zhuǎn)錄、胚失活、染色體穩(wěn)定和基因組印記等[13]。

圖 1.1 核小體“串珠模型”結(jié)構(gòu)修飾為 DNA 甲基化。在真核細(xì)胞中，DNA 二核苷酸胞嘧啶在合成后被 DNA 甲基，DNMT）將 S-甲硫腺苷（S-adenosylmethion的 C5 位置，轉(zhuǎn)化為 5-甲基胞嘧啶（5-methycy（圖 1.2）。DNA 的甲基化可以抑制轉(zhuǎn)錄因子與抑制基因表達(dá)功能的酶，從而造成基因沉默[12]的表觀遺傳修飾，參與許多細(xì)胞過程，包括基因染色體穩(wěn)定和基因組印記等[13]。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R91;R96

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本文編號：2647400