【摘要】：背景在受試細(xì)胞外形成的活性代謝物因其生物膜透過(guò)性不可確定,其對(duì)靶細(xì)胞的遺傳毒作用也受影響。在受試細(xì)胞外形成的帶負(fù)電荷的硫酸基結(jié)合物就不易進(jìn)入靶細(xì)胞,并且一些細(xì)胞色素P450(CYP)酶形成的代謝產(chǎn)物也可能不耐受轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。目前遺傳毒性試驗(yàn)中納入的代謝活性主要是采用大鼠肝S9混合物,在受試細(xì)胞外形成的活性代謝物對(duì)生物膜的透過(guò)性及對(duì)跨距離遷移的承受性可能會(huì)有差異,不同代謝產(chǎn)物在生物利用度上的差異對(duì)毒效應(yīng)的影響還缺少研究報(bào)道。目的本研究旨在揭示不同前致突變物在重組表達(dá)特定活化酶的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性代謝物后,對(duì)缺乏特異活化酶的受試細(xì)胞的遺傳毒作用差異,尤其是相較于受試物對(duì)相關(guān)代謝細(xì)胞直接作用的差異;以此了解體外代謝活化系統(tǒng)S9混合物對(duì)不同受試物遺傳毒性檢測(cè)效能的變異,并揭示重組表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系用于遺傳毒性試驗(yàn)的獨(dú)特價(jià)值。采用幾種常見(jiàn)的前致突變物,包括1-甲基芘[1-methylpyrene,1-MP,由CYPs和磺基轉(zhuǎn)移酶(SULTs)按次序經(jīng)二步反應(yīng)而活化]、1-羥甲基芘(1-hydroxymethyl pyrene,1-HMP,為1-MP的中間代謝物、依賴SULTs活化的前致突變物)、苯并(a)芘(Benzoapyrene,BaP,需要CYP1A1或CYP1B1活化的前致突變物)和黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1,需要CYP1A2或CYP3A4活化的前致突變物),觀察它們對(duì)表達(dá)其活化酶的重組V79細(xì)胞及與這些代謝型細(xì)胞以不同形式相交通的V79對(duì)照細(xì)胞誘發(fā)微核的作用。有關(guān)不同細(xì)胞間交通的形式包括:對(duì)照細(xì)胞與代謝細(xì)胞等比例混合培養(yǎng),對(duì)照細(xì)胞與代謝細(xì)胞通過(guò)0.4 μm的微孔和1 mm距離(結(jié)合transwell培養(yǎng)系統(tǒng))進(jìn)行物質(zhì)交換,以及受試細(xì)胞接受化學(xué)物與代謝細(xì)胞孵育后移出的培養(yǎng)液處理。微核試驗(yàn)的暴露/恢復(fù)時(shí)程為3h/21h。以Western blot法分析各受試細(xì)胞表達(dá)特定生物轉(zhuǎn)化酶的相對(duì)水平。結(jié)果1-MP對(duì)同時(shí)表達(dá)人CYP1A2和人SULT1A1的V79衍生細(xì)胞系(V79-hCYP1A2-hSULT1A1)明顯誘發(fā)微核形成,且效應(yīng)呈濃度相關(guān)性。在以下另外的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?1-MP也呈現(xiàn)相似的誘發(fā)微核作用:(1)表達(dá)人CYP1A2的重組V79細(xì)胞(V79-hCYP1A2)與表達(dá)人SULT1A1的重組V79細(xì)胞(V79-hSULT1A1)按1:1混合培養(yǎng),(2)應(yīng)用上述transwell系統(tǒng)使受試細(xì)胞V79-hSULT1A1 與V79-hCYP1A2細(xì)胞相交通,以及(3)受試細(xì)胞V79-hSULT1A1接受轉(zhuǎn)移自1-MP與V79-hCYP1 A2細(xì)胞孵育3h的培養(yǎng)液。1-HMP也對(duì)V79-hSULT1A1細(xì)胞明顯誘發(fā)微核,然而在以下模型中1-HMP誘發(fā)微核作用都明顯減弱:(1)受試細(xì)胞V79-Mz與V79-hSULT1A1在transwell系統(tǒng)中相交通,(2)V79-Mz細(xì)胞接受轉(zhuǎn)移自1-HMP與V79-hSULT1A]細(xì)胞孵育后的培養(yǎng)液處理。BaP和AFB1對(duì)V79細(xì)胞在Aroclor 1254誘導(dǎo)的大鼠肝臟S9混合物存在的條件下,均誘發(fā)微核形成,且效應(yīng)均呈濃度依賴性;與之相比較,相似效應(yīng)也在BaP對(duì)重組表達(dá)人CYP1A1的V79細(xì)胞(V79-hCYP1A1)的微核試驗(yàn)觀察到,而AFB1對(duì)V79-hCYP1 A2細(xì)胞的作用強(qiáng)度明顯增高。此外,BaP對(duì)與V79-hCYP1A1細(xì)胞相交通的V79-Mz細(xì)胞誘發(fā)微核作用與其對(duì)V79-hCYP1A1細(xì)胞的直接作用強(qiáng)度相似;相反,AFB1對(duì)與V79-hCYP1A2細(xì)胞相交通的V79-Mz在受試濃度下微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。結(jié)論本研究結(jié)果提示,1-MP的終毒物(1-甲磺基花,1-sulfoxymethylpyrene)擴(kuò)散進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)會(huì)遠(yuǎn)低于不帶電荷的1-HMP;而AFB1的活化產(chǎn)物(AFB1-8,9-環(huán)氧化物)對(duì)缺乏代謝能力的靶細(xì)胞的生物可及性很低(遠(yuǎn)低于BaP的活性代謝物),尤其不能經(jīng)受一定的擴(kuò)散距離,難以跨膜及跨距離轉(zhuǎn)運(yùn)而作用于靶細(xì)胞。本研究結(jié)果支持重組表達(dá)生物轉(zhuǎn)化酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系用于遺傳毒性試驗(yàn)的重要性。
【圖文】：

逑表達(dá)，，在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析前合并為計(jì)數(shù)資料，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；０．０５，邋＊＊尸＜逡逑０．０１，與對(duì)照組進(jìn)行比較。１－ＭＰ對(duì)Ｖ７９－ｈＣＹＰｌＡ２－ｈＳＵＬＴｌＡｌ細(xì)胞的直接作用是圖３－１相關(guān)逡逑數(shù)據(jù)的重復(fù)表達(dá)，而１－ＨＭＰ對(duì)Ｖ７９－ｈＳＵＬＴ丨Ａ１細(xì)胞的直接作用是圖３－３相關(guān)數(shù)據(jù)的重復(fù)表逡逑達(dá)。逡逑Ｆｉｇ．邋３－４邋Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋Ｖ７９－ＨＳＵＬＴ１Ａ１邋ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ邋ｆｒｏｍ逡逑１－ＭＰ－ｔｒｅａｔｅｄ邋Ｖ７９－ｈＣＹＰｌＡ２邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ａｓ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈａｔ邋ｉｎ邋Ｖ７９－Ｍｚ邋ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑ｆｒｏｍ邋１－ＨＭＰ－ｔｒｅａｔｅｄ邋Ｖ７９－ｈＳＵＬＴｌＡｌ逡逑Ｃｅｌｌ邋ｇｒｏｗｔｈ／ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ａｎｄ邋ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｉ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋Ｖ７９－ｈＳＵＬＴｌ邋Ａ１邋ｃｅｌｌｓ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｌ－ＭＰ－Ｖ７９－ｈＣＹＰｌ邋Ａ２邋ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｓ邋（ｐａｎｅｌｓ邋Ａ１邋ａｎｄ邋Ａ２）邋ａｎｄ邋ｔｈａｔ邋ｉｎ邋Ｖ７９－Ｍｚ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ邋ｌ－ＨＭＰ－Ｖ７９－ｈＳＵＬＴｌＡｌ邋ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｓ邋（ｐａｎｅｌｓ邋Ｂ１邋ａｎｄ邋Ｂ２）．邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ｏｆ邋１－ＭＰ邋ｉｎ逡逑Ｖ７９－ｈＣＹＰｌＡ２－ｈＳＵＬＴｌ邋Ａ１邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ邋ａｐｐｅａｒｅｄ邋ｉｎ邋Ｆｉｇ．３－１邋ａｎｄ邋ｒｅｕｓｅｄ邋ｈｅｒｅ邋ｆｏｒ邋ａ邋ｄｉｒｅｃｔ逡逑ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ

二勺，導(dǎo)擬2commUn吻bletO、叮斗hCYp，從仁創(chuàng)!日
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R99

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本文編號(hào)：2642930