【摘要】：小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)可以特異性沉默靶基因的表達(dá),是治療惡性腫瘤的重要新興策略。但siRNA存在體內(nèi)穩(wěn)定性差、循環(huán)時間短、轉(zhuǎn)染效率低、內(nèi)涵體逃逸困難等問題。因此,構(gòu)建有效的siRNA遞送體系是高效沉默細(xì)胞內(nèi)靶基因的重要前提。本課題結(jié)合工程學(xué)、材料學(xué)等多學(xué)科研究方法構(gòu)建高效遞送siRNA的納米體系,并利用生物信息學(xué)分析確定細(xì)胞分裂周期蛋白20(Cell division cycle protein 20,CDC20)作為治療靶點,旨在提高腫瘤治療效果,并減少對正常組織的非特異性毒副作用。微流控(Microfluidic,MF)是指在納米或微米級別的通道中操控微量流體的技術(shù)。流體在微小尺寸的流道內(nèi)呈層流狀態(tài),且流體運動行為高度可控。與傳統(tǒng)納米粒制備方法相比,MF技術(shù)可以通過改變芯片形狀、流體流速、流量、混合順序等因素精密控制層流液體混合效應(yīng),是一種有效的合成粒徑均一、批次質(zhì)量可控的納米粒的工程學(xué)工具。智能生物響應(yīng)性材料可在機(jī)體特定生物環(huán)境(包括pH、氧化還原、酶、葡萄糖、乏氧、ATP)中發(fā)生溶脹、收縮、解離、降解等物理化學(xué)變化,由智能生物響應(yīng)性材料組裝形成的納米粒可實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)釋放,最大程度發(fā)揮藥物作用,減小毒副作用。鑒于siRNA遞送存在的問題及腫瘤組織特殊微環(huán)境,本研究采用MF技術(shù)制備了乏氧和pH雙響應(yīng)的多功能siRNA脂質(zhì)納米粒,并對其抗腫瘤效果進(jìn)行了研究,具體內(nèi)容概括如下:1.微流控技術(shù)制備基于pH響應(yīng)的靶向siRNA脂質(zhì)納米粒及其抗腫瘤研究本研究設(shè)計了含有“人字形”被動混合器的MF芯片,用于制備基于pH響應(yīng)的轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向的siRNA脂質(zhì)納米粒(Tf-LNPs),并研究其體外和體內(nèi)抗腫瘤效果。結(jié)果顯示,我們通過MF芯片采用“一步法”簡單高效地制備了Tf-LNPs,且與傳統(tǒng)方法制備的脂質(zhì)納米粒相比,粒徑分布更窄、顯著改善了體內(nèi)分布情況,顯示了更強(qiáng)的抗腫瘤效果。這種基于MF技術(shù)開發(fā)的納米載體為腫瘤治療提供了新的策略和思路。2.乏氧響應(yīng)的生物高分子材料的合成及治療靶點的生物信息學(xué)分析首先我們通過2-硝基咪唑(2-Nitroimidazole,2-NI)和6-(叔丁基氨基)己基溴(6-(t-Boc-amino)hexyl bromide,BAHB)之間的偶聯(lián)反應(yīng)合成乏氧響應(yīng)的6-(2-硝基咪唑)己胺(6-(2-nitroimidazole)hexylamine,NIHA);又以mPEG-NH_2為大分子引發(fā)劑引發(fā)γ-苯甲基-L-谷氨酸酯N-內(nèi)羧酸酐(BLG NCA)開環(huán)聚合,并脫除苯甲基保護(hù)合成兩嵌段共聚物mPEG-b-PLG;最后以EDC·HCl和NHS分別作為縮合劑和催化劑,將合成的NIHA與mPEG-b-PLG中LG結(jié)構(gòu)單元的側(cè)羧基結(jié)合,合成mPEG-b-P(LG-g-NI)。核磁共振圖譜顯示,所有信號峰均進(jìn)行了準(zhǔn)確歸屬,而且各個信號峰的積分比與結(jié)構(gòu)式中氫的比例吻合,從而證明了NIHA、mPEG-b-PLG和mPEG-b-P(LG-g-NI)的成功合成。其次,通過生物信息學(xué)統(tǒng)計顯示,在腫瘤組織中CDC20的過表達(dá)與乏氧呈正相關(guān)性,并與病人的不良預(yù)后密切相關(guān)。3.乏氧響應(yīng)的siRNA納米粒的制備及其抗腫瘤研究在乏氧條件下,2-NI可通過一系列硝基還原酶催化的單電子還原,轉(zhuǎn)化為親水性的2-氨基咪唑(2-Aminoimidazole,2-AI),在分子探針和前藥聚合物中廣泛應(yīng)用。本研究將2-NI修飾的聚氨基酸共聚物mPEG-b-P(LG-g-NI)與陽離子類脂化合物組合形成乏氧響應(yīng)納米粒(Hypoxia-responsive nanoparticle,HRNP),用于遞送CDC20 siRNA。體外結(jié)果表明,HRNP/siRNA在10.0 nM濃度時可高效敲除90%的靶基因,無明顯細(xì)胞毒性;體內(nèi)實驗表明,HRNP/siRNA在腫瘤組織中具有較高的腫瘤積聚,與空白對照相比,體內(nèi)的抑瘤率高達(dá)85%,有效抑制腫瘤的生長。4.微流控制備乏氧與酸雙響應(yīng)的siRNA納米粒及其抗腫瘤研究基于上述研究基礎(chǔ),本研究采用微流控技術(shù),制備合成了乏氧-pH雙響應(yīng)的siRNA脂質(zhì)納米粒(Hypoxia and pH dual-responsive lipid nanoparticle,hpLNP),并對體內(nèi)外siRNA沉默效果進(jìn)行了考察。實驗結(jié)果表明,該hpLNP納米粒粒徑均一,在pH=6.5條件下,hpLNP質(zhì)子化和PEG外殼的脫落導(dǎo)致電位由負(fù)變正,增加了腫瘤細(xì)胞的攝取。進(jìn)入細(xì)胞后,hpLNP在乏氧條件下的快速釋放siRNA,最終達(dá)到腫瘤靶向以及高效的基因沉默效果。綜上所述,本研究設(shè)計了新型MF芯片,能夠通過“一步法”制備粒徑均一的納米粒,結(jié)合乏氧及pH響應(yīng)性材料,能夠高效遞送siRNA并介導(dǎo)基因沉默,達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。這種微流控技術(shù)結(jié)合響應(yīng)性高分子材料制備納米粒的策略具有簡單、可控、重復(fù)性高的特點和優(yōu)勢,在siRNA納米遞送體系的臨床轉(zhuǎn)化方面具有良好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

第 1 章 緒 論簡介定義及其作用機(jī)制A（Small interfering RNA, siRNA）是由 Dicer 蛋白剪RNA（Double-strand siRNA, dsRNA）得到的具有 21 該 siRNA能夠在Dicer蛋白的幫助下，與Ago蛋白結(jié)合（RNA-induced silencing complex, RISC），其中正義與靶基因通過堿基互補(bǔ)配對，誘導(dǎo)靶基因的特異性剪現(xiàn)象[3-6]，此機(jī)制被稱為 RNA 干擾（RNA interfering

第 1 章 緒論酸酶降解等因素，致使其具有半衰期短，轉(zhuǎn)染效率低的缺點。siRNA 需要克服重重障礙才能達(dá)到高效的 RNAi 效果。具體地，當(dāng) siRNA 經(jīng)靜脈注射進(jìn)入血液后，，需要依次克服血液中核酸酶的降解，避免腎臟的消除，并穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)入各組織器官。到達(dá)組織內(nèi)后的 siRNA 又需與靶細(xì)胞結(jié)合，通過內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，并成功從溶酶體內(nèi)逃逸到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，才能真正發(fā)揮 RNAi 作用。因此，能否高效遞送 siRNA 是目前亟待解決的問題之一[9, 10]。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96;R943

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本文編號：2642311