【摘要】：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是累及胃腸道的一組慢性炎癥疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。其易復(fù)發(fā)、遷延不愈,還可能向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)變。目前發(fā)病機制未完全闡明,用于臨床治療的藥物主要包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤壞死因子和抗粘附療法等,但在使用過程中由于其藥物特性和非特異性分布可能導(dǎo)致各種副作用。因此,開發(fā)特異、有效和安全的IBD治療藥物具有重要臨床意義。在IBD的發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥分子、免疫細胞和微生物群落共同形成了腸道促炎性微環(huán)境,從而引起IBD。我們推測將IBD的異常炎癥微環(huán)境恢復(fù)正�？赡苁且环N有效治療IBD的新策略。最新研究證實,炎癥的消退是由抑炎分子介導(dǎo)的主動過程,它們能夠抑制炎性細胞因子的表達、促進凋亡的細胞和微生物的清除。膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1)是一種內(nèi)源性的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白,參與抗炎反應(yīng)、細胞的增殖、分化、死亡信號調(diào)控。Ac2-26是Annexin A1 N-末端衍生肽,具有整個蛋白的藥理活性。該肽可以抑制炎癥反應(yīng)的各個方面,減少中性粒細胞和單核細胞/巨噬細胞的浸潤。炎癥性腸病的病理過程伴隨著大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成,進而導(dǎo)致氧化應(yīng)激失衡和機體損傷。本課題期望通過構(gòu)建活性氧響應(yīng)性納米載體包載內(nèi)源性抗炎多肽Ac2-26來達到改善腸道炎癥微環(huán)境,治療炎癥性腸病的目的。為了驗證該假設(shè),通過在β-環(huán)糊精(β-CD)的骨架上共價連接苯硼酸頻哪醇酯,成功合成了具有ROS清除和響應(yīng)特性的新型可降解納米材料(OxbCD),并包載抗炎多肽Ac2-26制備形成納米粒(Ac2-26/OxbCD NP,AON)�？疾炝薃ON在各種急、慢性結(jié)腸炎中的療效,并對其作用機制進行深入研究。方法1.載Ac2-26抗炎多肽納米藥物的制備與表征4-羥甲基苯硼酸頻哪醇酯(PBAP)作為活性氧響應(yīng)性基團,將PBAP與β-CD鍵合,得到ROS響應(yīng)性載體材料OxbCD。通過核磁共振氫譜(~1H NMR)和紅外光譜(FT-IR)來確定OxbCD的結(jié)構(gòu)。以DSPE-PEG、卵磷脂溶于水相,Ac2-26、OxbCD溶于甲醇作為油相,采用納米沉淀法構(gòu)建Ac2-26/OxbCD納米粒(AON)。采用相同的方法構(gòu)建空白納米載體(ON)和包載Ac2-26的PLGA納米粒(APN)。采用透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)觀察形態(tài),激光粒度儀(DLS)測定粒徑和Zeta電位。通過熒光分光光度計測定AON的包封率和載藥量。2.AON的活性氧響應(yīng)性水解、體外釋放和穩(wěn)定性測定AON在H_2O_2存在下于不同的時間點的水解率。采用熒光分光光度計測定AON在含或不含1 mM H_2O_2的PBS中的藥物釋放率,同時考察在模擬胃腸道環(huán)境下的釋放情況。采用高效液相色譜法(HPLC)分別考察Ac2-26和AON在人工胃液、胃沖洗液、胃勻漿液,人工腸液、腸沖洗液、腸勻漿液中孵育2 h的穩(wěn)定性。3.AON的細胞水平初步安全性和細胞攝取考察采用MTT法測試不同劑量的AON、ON、APN對小鼠巨噬細胞RAW264.7的細胞毒性。將FITC-AON與小鼠巨噬細胞RAW264.7共孵育一定時間,采用激光共聚焦顯微鏡觀察納米粒的細胞吞噬情況。另外,還通過流式細胞儀分析RAW264.7細胞中FITC-AON的熒光強度,同時考察納米粒被細胞攝取的時間依賴性和劑量依賴性。4.AON的細胞水平抗氧化、抗炎效應(yīng)考察采用膜聯(lián)蛋白V/PI試劑盒考察了AON對高濃度H_2O_2導(dǎo)致的巨噬細胞凋亡的保護作用。采用熒光顯微鏡拍照觀察和流式細胞術(shù)檢測AON對PMA刺激RAW264.7細胞產(chǎn)生的ROS的抗氧化效應(yīng)�？疾霢ON對LPS刺激RAW264.7細胞分泌TNF-α的抗炎效應(yīng)。5.體外細胞實驗考察AON對炎性細胞的影響在3%巰基乙酸鹽誘導(dǎo)的小鼠腹腔灌洗液中提取中性粒細胞,Transwell小室考察AON對中性粒細胞遷移的影響。將中性粒細胞膜用DIO進行標(biāo)記、自然凋亡后,流式細胞儀考察AON對巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞的影響。用LPS和IFN-γ刺激RAW264.7細胞,考察AON對巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化的影響。6.AON對急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸靶向性研究DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠口服Cy7.5-AON,在不同時間點處死小鼠,對其小腸、腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎、結(jié)腸以及血液進行活體成像,統(tǒng)計小鼠各臟器熒光強度。同樣的,灌胃給予小鼠AON,在不同時間點處死小鼠,高效液相色譜(HPLC)測定結(jié)腸、血液、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和腎臟中Ac2-26的含量。給予小鼠灌胃FITC-AON4 h后,取小鼠結(jié)腸組織,切片采用激光共聚焦顯微鏡觀察。給予小鼠灌胃Cy5-AON 4h后,用流式細胞儀檢測納米粒在結(jié)腸部位巨噬細胞和中性粒細胞的攝取量。7.AON對幾種急慢性結(jié)腸炎小鼠模型的治療作用評價C57BL/6小鼠飲用不同濃度的DSS建立小鼠急、慢性結(jié)腸炎模型。IL-10~(-/-)小鼠自發(fā)形成慢性結(jié)腸炎模型。按250μg/kg Ac2-26的劑量,按給藥方案分別給予口服Ac2-26、ON、APN或AON。每日觀察記錄小鼠體重、糞便情況,實驗結(jié)束后,處死小鼠,結(jié)腸拍照,測定結(jié)腸長度,采集血液進行血常規(guī)和肝腎功能分析,收集包括結(jié)腸在內(nèi)的主要臟器進行切片,HE染色。檢測結(jié)腸組織勻漿液中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)MPO、MDA、H_2O_2和炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ情況。通過腸鏡和免疫熒光染色觀察急性結(jié)腸炎小鼠治療后的腸黏膜恢復(fù)情況。8.AON的體內(nèi)初步安全性評價通過灌胃給予C57BL/6小鼠5 g/kg的AON進行急性毒性實驗考察。在不同的時間點記錄小鼠的體重,采集血樣進行血常規(guī)和肝腎功能分析。取主要的臟器稱重后固定,進行HE染色。9.AON體外抗炎和抗氧化作用機制研究采用非選擇性甲酰肽受體(FPR)拮抗劑Boc2和選擇性FPR2拮抗劑WRW4對AON抗炎、抗氧化、抗中性粒細胞遷移和促進巨噬細胞吞噬作用機制進行研究。10.AON對炎性細胞浸潤和黏膜修復(fù)的影響急性結(jié)腸炎小鼠每日分別給予口服Ac2-26、ON、APN或AON。第7天實驗結(jié)束后處死小鼠,流式細胞儀測定結(jié)腸組織中巨噬細胞和中性粒細胞數(shù)量或于7天各組小鼠灌胃給予FITC-Dextran,熒光分光光度光度計測定血液中FITC-Dextran熒光強度,從而評價AON對急性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜修復(fù)的影響。11.AON對炎癥消退的影響B(tài)alb/c小鼠腹腔注射酵母多糖建立小鼠急性腹膜炎模型。按Ac2-26劑量500 ng/只腹腔注射Ac2-26、ON、APN或AON,取腹腔灌洗液分別測定MDA、MPO、H_2O_2、TNF-α和IL-1β含量,流式細胞儀測定腹腔灌洗液中性粒細胞含量。在另外一項研究中,腹膜炎小鼠腹腔注射生理鹽水或AON,分別于不同時間點取腹腔灌洗液測定中性粒細胞比例。12.AON對結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用急性結(jié)腸炎小鼠每日分別給予口服生理鹽水或AON。第7天實驗結(jié)束后取小鼠糞便。16S rRNA檢測腸道菌群種類和豐度,GC-MS測定糞便中短鏈脂肪酸的含量。結(jié)果1.基于β-CD和PBAP,合成了ROS響應(yīng)性材料OxbCD,并對材料進行了FT-IR和~1H NMR表征。~1H NMR顯示,一個β-CD骨架分子上大約共價鍵合了7個PBAP單元。通過納米沉淀/自組裝的方法可以制備得到包載Ac2-26的ROS響應(yīng)性納米粒AON,平均粒徑為202±4 nm,zeta電位為-37.4±0.6 mV,包封率為42.8±2.8%,載藥量為0.86±0.06μg/mg。AON在H_2O_2存在下能迅速發(fā)生水解和釋放藥物。HPLC測定Ac2-26溶液和納米粒在各模擬胃、腸液中的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)Ac2-26溶液在各模擬液中孵育2 h后,多肽發(fā)生了完全降解;而AON中,Ac2-26穩(wěn)定存在,說明納米粒對Ac2-26有很好的保護作用,穩(wěn)定性大大提高。2.體外細胞實驗表明,在1000μg/mL范圍內(nèi)AON對巨噬細胞RAW264.7生存率沒有明顯的影響。通過激光共聚焦顯微鏡和流式檢測均表明RAW264.7細胞能夠有效吞噬AON,且吞噬作用呈時間和劑量依賴性。另外,AON能明顯抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡,有效清除PMA刺激細胞產(chǎn)生的活性氧和LPS刺激細胞分泌的炎癥因子TNF-α,并且其效果優(yōu)于Ac2-26、空白載體納米粒ON和PLGA制備的載藥納米粒APN。3.對炎性細胞的調(diào)控方面,AON可以抑制中性粒細胞的遷移,顯著促進巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞,促進巨噬細胞表型從炎癥性M1表型(F4/80~+CD86~+)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N活化的具有抗炎效應(yīng)的M2表型(F4/80~+CD206~+)。4.急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸靶向?qū)嶒炞C明,Cy7.5-AON在急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸部分的熒光強度明顯高于健康小鼠。小鼠灌胃口服Cy7.5-AON后,結(jié)腸部位熒光強度明顯高于Cy7.5-Ac2-26溶液組。而Cy7.5-Ac2-26組在血液和與吸收,代謝和排泄有關(guān)的臟器中表現(xiàn)出更高的非特異性熒光分布,進一步證明AON的高效低毒特性。熒光共聚焦顯微鏡也能觀察到FITC-AON具有更好的結(jié)腸炎靶向富集作用。HPLC檢測發(fā)現(xiàn)Ac2-26組結(jié)腸組織中的藥物含量在4 h和24 h時遠低于AON組的Ac2-26含量。流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)AON具有更好的炎性細胞靶向性,被炎性結(jié)腸的巨噬細胞和中性粒細胞攝取量更大。5.為評價AON對結(jié)腸炎的治療效果,我們建立了DSS誘導(dǎo)的小鼠急性和慢性結(jié)腸炎模型以及IL-10~(-/-)小鼠自發(fā)形成的慢性結(jié)腸炎模型,口服AON進行干預(yù)治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在上述的三種急、慢性結(jié)腸炎模型中,具有ROS響應(yīng)性的AON能夠有效緩解模型小鼠體重降低,減輕疾病指數(shù)和結(jié)腸黏膜炎癥狀況,降低模型小鼠結(jié)腸部位炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的含量,同時對其他器官也并無明顯毒性,其療效優(yōu)于Ac2-26、ON、Ac2-26和ON混合物以及APN。6.在體內(nèi)初步的安全性評價實驗中,通過灌胃給予5 g/kg AON后,小鼠的體重、臟器指數(shù)、血常規(guī)和肝腎功與正常小鼠相比無明顯差異。同樣,小鼠主要臟器的HE切片也沒有發(fā)現(xiàn)明顯病變。7.通過對AON抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用機制研究發(fā)現(xiàn),AON主要通過FPR-1受體介導(dǎo)抑制氧化應(yīng)激所致的RAW264.7細胞凋亡。而通過FPR-2受體介導(dǎo)降低LPS引起的TNF-α炎癥因子分泌。也是通過激活FPR-2受體抑制中性粒細胞遷移以及促進巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞。8.AON處理能夠減少DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸部位中性粒細胞和巨噬細胞的募集。通過灌胃給予各組處理小鼠FITC-Dextran反映腸段通透性變化,發(fā)現(xiàn)AON干預(yù)能夠?qū)Y(jié)腸黏膜起到有效的保護作用,促進潰瘍性創(chuàng)面的愈合。9.在小鼠腹膜炎模型中,與Ac2-26、ON以及APN相比,AON在治療上表現(xiàn)出更優(yōu)的效果。通過對腹膜炎小鼠腹腔灌洗液進行檢測,測定其中的中性粒細胞比例以及氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)指標(biāo)含量。結(jié)果顯示,AON能夠降低中性粒細胞浸潤的最大數(shù)量(Ψmax)和減少中性粒細胞達到Ψmax的時間點與對應(yīng)于~50%中性粒細胞減少的時間點之間的間隔(Ri),緩解氧化應(yīng)激和降低炎癥因子水平,加速炎癥消退。10.AON干預(yù)能增加結(jié)腸炎小鼠腸道菌群多樣性,減少感染性埃希氏菌-志賀氏菌的數(shù)量和提高短鏈脂肪酸(SCFAs)產(chǎn)生菌Prevotellaceae的豐度,同時增加SCFAs的含量,調(diào)節(jié)腸道菌群特征從失調(diào)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槠胶鉅顟B(tài)。結(jié)論1.本課題通過β-CD與PBAP的共價鍵合,成功構(gòu)建了一種ROS響應(yīng)性載體材料OxbCD,將其包載抗炎多肽Ac2-26構(gòu)建了具有抗氧化應(yīng)激和和抗炎功能的納米藥物AON。并證明了AON具有特異性H_2O_2響應(yīng)性,而且能夠提高Ac2-26的穩(wěn)定性。2.AON在細胞水平能夠有效地被巨噬細胞吞噬,可以降低細胞氧化應(yīng)激和炎癥水平,抑制中性粒細胞遷移、促進巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞和誘導(dǎo)巨噬細胞從促炎型向抑炎型轉(zhuǎn)化。3.AON口服后能夠有效地靶向到結(jié)腸炎癥部位和炎性細胞。在三種急慢性結(jié)腸炎模型中,AON能夠有效地減輕氧化應(yīng)激,抑制病變結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng),呈現(xiàn)良好的治療效果。體內(nèi)初步安全性評價表明,AON可以作為一種安全的口服納米治療藥物。4.通過對AON抗結(jié)腸炎作用機制研究發(fā)現(xiàn),AON通過激活FPR2發(fā)揮其抗炎作用,通過激活FPR1通路發(fā)揮降低氧化應(yīng)激作用。AON可以減少炎性細胞浸潤,促進炎癥消退,恢復(fù)腸上皮屏障功能,增加腸道菌群多樣性和SCFAs的含量,從而調(diào)節(jié)腸道炎癥微環(huán)境。
【圖文】：

Figure 2. Synthetic scheme of OxbCD.圖2. OxbCD 的合成路線圖。如圖 2 所示，通過設(shè)計簡單的邁克爾加成反應(yīng)，，對 β-CD 修飾氧化應(yīng)激響應(yīng)性基團備得到 ROS 響應(yīng)性的 β-CD 載體材料。2.1.2.2 OxbCD 的紅外光譜表征4200 3600 3000 2400 1800 1200 600 -CDOxbCD

5.2.2 結(jié) 果Figure 52. Schematic illustration of treatment regimens.圖52. 急性結(jié)腸炎模型的建立以及給藥方案示意圖。5.2.2.1 小鼠急性結(jié)腸炎病理學(xué)評價0 1 2 3 4 5 6 7708090100Weight(%)DaysNormalColitisONAPNAON*****Figure 53. The body weight of mice during a 7-day treatment course. Data are normalized as thepercentages of the body weight at day 0. **P < 0.01 and ***P < 0.001 versus the colitis group. All data arepresented as mean ±SE (n = 6).圖53. DSS 誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠在 7 天內(nèi)的體重變化情況。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R96


本文編號：2642308