【摘要】：人體內(nèi)膽固醇含量過高會引起許多疾病,尤其是心血管疾病。膽固醇主要由內(nèi)源性合成而來,占總體的80%。內(nèi)源性合成的最后一步反應(yīng)為鏈甾醇還原為膽固醇,催化此反應(yīng)的酶為DHCR24(3β-脫氫膽固醇-Δ24還原酶)。DHCR24基因的突變(單點(diǎn)突變E191K、N294T、K306N、Y471S和兩點(diǎn)突變N294T/K306N)會導(dǎo)致酶活性降低,從而使細(xì)胞膽固醇的含量下降。本實(shí)驗(yàn)研究以DHCR24蛋白為靶點(diǎn),以期尋找到通過抑制DHCR24酶活性從而降低細(xì)胞膽固醇的新型降膽固醇藥物。傳統(tǒng)的藥物篩選研發(fā)成本高并且周期很長,本研究利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選聯(lián)合細(xì)胞平臺篩選技術(shù),以達(dá)到節(jié)約時(shí)間和成本,并且提高篩選陽性率的目的。此外,本研究選用現(xiàn)有藥物小分子數(shù)據(jù)庫,可以提高候選藥物的安全性,進(jìn)一步為研發(fā)藥物節(jié)約時(shí)間與成本,提高篩選效率。本實(shí)驗(yàn)首先通過同源建模和分子動(dòng)力學(xué)技術(shù)建立、優(yōu)化并確定DHCR24蛋白結(jié)構(gòu)模型。然后利用分子對接及虛擬篩選技術(shù),在DrugBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行初步篩選,得到可能能夠競爭性抑制DHCR24與底物desmosterol結(jié)合的小分子藥物,選取其中打分最優(yōu)的50個(gè)現(xiàn)有藥物小分子候選藥物。接下來對這50個(gè)候選藥物進(jìn)行AutoDock 4精確對接,并進(jìn)行聚類分析。然后根據(jù)其易獲得性進(jìn)行進(jìn)一步篩選,最終確定了4個(gè)候選藥物(OND1,OND2,OND3,OND4)。我們利用人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞培養(yǎng)平臺聯(lián)合高效液相色譜法(HPLC),驗(yàn)證篩選出的4種藥物抑制DHCR24酶活性從而降低細(xì)胞膽固醇含量的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,這四種藥物組以及一組陽性對照組U18666A(已知的DHCR24抑制劑)在給定劑量下都能顯著降低細(xì)胞膽固醇的含量,初步證明了虛擬篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。接下來,我們利用固醇熒光染色法(非律平)再次驗(yàn)證四種小分子藥物的降膽固醇效果。結(jié)果顯示四種藥物降膽固醇的效果均非常顯著。最后,我們利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法,對四種候選藥物抑制DHCR24酶活性的具體機(jī)制進(jìn)行了初步研究。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)了四種新型DHCR24抑制劑,并經(jīng)過初步的細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn),證明其有降低細(xì)胞膽固醇的效果,為將其進(jìn)一步開發(fā)為以DHCR24為靶點(diǎn)的新型降膽固醇藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究的完成為以DHCR24為靶點(diǎn)開發(fā)新型降膽固醇藥物提供了新的思路。
【圖文】：

2圖 0-1 膽固醇內(nèi)源性合成途徑0.1.3 降膽固醇藥物的研發(fā)現(xiàn)狀傳統(tǒng)的內(nèi)源性降膽固醇藥物，其種類主要為他汀類藥物，作用機(jī)理主要是通過抑制膽固醇生物合成過程初始階段的酶——HMG-CoA 來實(shí)現(xiàn)。藥效方面主要可以降低 TC 和 LDL-C 水平，提高 HDL-C 水平。然而他汀類藥物的副作用很大，長期服用會導(dǎo)致橫紋肌溶解[4]，腸胃不適，高血壓，高血糖以及肝酶升高等癥狀[5-6]。其他降膽固醇的藥物有：1.貝特類（如苯扎貝特，非諾貝特等），長期服用也會導(dǎo)致皮疹，腸道功能紊亂和膽結(jié)石等不良反應(yīng)；2.煙酸類其不良反應(yīng)相對輕微。

圖 1-1 預(yù)測并優(yōu)化的 DHCR24 三維結(jié)構(gòu)模型.2 對接結(jié)果及結(jié)合口袋的確定desmosterol 與 DHCR24_FAD 復(fù)合物的最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象的 AutoDock vina（binding energy）為-8.4 Kcal/mol。以此構(gòu)象為基礎(chǔ)，利用 AutoDock該結(jié)構(gòu)進(jìn)行再次精確對接（5000 次對接），將對接后各個(gè)結(jié)合構(gòu)象的進(jìn)行綜合分析，可以選定其中能量最低簇并且其構(gòu)象最為集中的紅色圖 1-3 A）。選擇其中形成一個(gè)氫鍵的第一個(gè)構(gòu)象，確定其為最佳構(gòu)象活性中心（DHCR24 結(jié)合底物 desmosterol 的疏水口袋），從而為后續(xù)選確定了活性中心范圍。根據(jù)以上對接結(jié)果，，并經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，最終性口袋的設(shè)置條件。以 desmosterol 與 DHCR24_FAD 復(fù)合物結(jié)合口袋）為活性中心：中心坐標(biāo) x=72.193，y=51.112，z=24.362；網(wǎng)格大小 8×步長（spacing）設(shè)置為 1。
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R972.6

【參考文獻(xiàn)】

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1 袁安;聶坤;闞伯紅;韓景獻(xiàn);于建春;;膽固醇細(xì)胞化學(xué)染色方法的比較與分析[J];中國病理生理雜志;2010年08期

2 沈寅初;膽固醇合成抑止劑的研究開發(fā)[J];上海化工;1998年11期

本文編號：2642306