【摘要】：中空介孔二氧化鈦(TiO_2)作為聲敏劑在超聲下可產(chǎn)生活性氧(ROS)而具有聲動(dòng)力學(xué)治療(SDT)的作用。但該納米粒在腫瘤部位蓄積量較少,且其所介導(dǎo)的聲療效果受腫瘤深部乏氧環(huán)境的限制。為解決該問(wèn)題,本課題構(gòu)建了基于血紅蛋白(Hb)聯(lián)合聲療和化療的仿生遞藥系統(tǒng)(CCM-Hb-TiO_2/RRx-001)。該體系具有以下特點(diǎn):1)納米粒在MCF-7人乳腺癌細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞膜(CCM)的偽裝下,在血循環(huán)中免疫逃逸后同源靶向到腫瘤組織。2)Hb在乏氧的腫瘤組織釋放氧氣,增敏TiO_2的SDT效果。3)RRx-001一方面增強(qiáng)脫氧Hb(Deoxy-Hb)的亞硝酸鹽還原酶活性,將腫瘤部位亞硝酸鹽(NO_2~㧟)還原為一氧化氮(NO),具有一定的擴(kuò)血管和抗腫瘤效果;另一方面還可消耗腫瘤細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽(GSH),進(jìn)而提高ROS水平,協(xié)同SDT。因此,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001可基于Hb聯(lián)合SDT和化療,協(xié)同增加胞內(nèi)活性氧和活性氮物質(zhì)(RONS),促進(jìn)細(xì)胞凋亡、DNA斷裂,增強(qiáng)抗瘤活性。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.首先,以合成二氧化硅為模板,通過(guò)溶膠凝膠法和煅燒、刻蝕等過(guò)程制備中空介孔TiO_2納米粒。然后用3-氨丙基三乙氧基硅烷使TiO_2表面氨基功能化,再經(jīng)酰胺化反應(yīng)共價(jià)修飾Hb。隨后以超聲分散法負(fù)載抗癌新藥RRx-001,最后與MCF-7細(xì)胞經(jīng)低滲裂解、勻漿、差速離心而得的CCM共擠壓,得到CCM-Hb-TiO_2/RRx-001。通過(guò)透射電鏡、傅里葉紅外光譜、紫外可見(jiàn)光譜等證實(shí)了CCM-Hb-TiO_2/RRx-001的成功制備,納米粒度分析儀測(cè)得最終粒徑為145.6±3.6 nm,電位為㧟21.7±1.0 mV。氧氣釋放實(shí)驗(yàn)中,以三(4,7-二苯基-1,10-鄰菲Up啉)二氯化釕(Ru(dpp)_3Cl_2)為氧氣指示劑,測(cè)得CCM-Hb-TiO_2/RRx-001的氧氣釋放量是游離Hb的2.5倍左右。以SOSG為ROS檢測(cè)探針,CCM-Hb-TiO_2比CCM-TiO_2能產(chǎn)生更多的ROS,且具有超聲時(shí)間依賴(lài)性。此外,GSH含量測(cè)定結(jié)果也顯示,隨RRx-001濃度依賴(lài)性的降低。2.體外實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)將紅色熒光染料尼羅紅(NR)負(fù)載到制劑中,以Hb-TiO_2/NR為對(duì)照,考察6種不同來(lái)源細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-231、Hs538Bst、HepG2、NIH 3T3、RAW 264.7)對(duì)MCF-7來(lái)源細(xì)胞膜包覆的CCM-Hb-TiO_2/NR的攝取情況,證實(shí)了該納米系統(tǒng)的同源靶向性(MCF-7細(xì)胞中增強(qiáng)的紅色熒光)和免疫逃逸特性(RAW 264.7細(xì)胞中減弱的紅色熒光)。選用MCF-7細(xì)胞為考察對(duì)象,分別以DHE和DAF-FM DA為ROS和NO檢測(cè)探針,通過(guò)熒光定性和流式定量結(jié)果表明,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001在超聲下(1 W cm~(-2),1 MHz,30 s)能顯著增加細(xì)胞中ROS和NO水平。胞內(nèi)GSH含量的測(cè)定結(jié)果顯示,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001在超聲下可降低胞內(nèi)GSH水平至40%左右,有利于提高胞內(nèi)ROS水平。以SRB法評(píng)價(jià)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,載體CCM-Hb-TiO_2無(wú)明顯毒性,而制劑組CCM-Hb-TiO_2/RRx-001在超聲下導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著下降(19.0±2.2%)。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,將近紅外熒光染料IR783負(fù)載到制劑中,以荷MCF-7瘤以及同時(shí)荷MCF-7瘤和HepG2瘤的裸鼠為模型,觀察尾靜脈注射Hb-TiO_2/IR783和CCM-Hb-TiO_2/IR783后在裸鼠體內(nèi)的分布情況�；铙w成像結(jié)果顯示,MCF-7來(lái)源細(xì)胞膜包覆的CCM-Hb-TiO_2/IR783對(duì)體內(nèi)MCF-7瘤具有同源特異靶向性,可增加制劑在腫瘤部位的蓄積。腫瘤組織的切片結(jié)果表明,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001可使腫瘤部位血管擴(kuò)張,同時(shí)增加腫瘤部位的藥物分布,并降低HIF-1α的表達(dá)。給予超聲照射(1 W cm~(-2),1 MHz,30 s)后,可明顯增加腫瘤部位的ROS和NO水平。藥效實(shí)驗(yàn)中,CCM-Hb-TiO_2/RRx-001組在超聲下的相對(duì)瘤體積降至1.17±0.10,顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí),HE染色發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞破碎,TUNEL檢測(cè)到嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡,γ-H2AX顯示較多的DNA雙鏈斷裂。另外,各組小鼠體重、各主要器官組織的HE染色等均無(wú)明顯異常變化,表明CCM-Hb-TiO_2/RRx-001在體內(nèi)具有較好的生物安全性。綜上所述,MCF-7來(lái)源細(xì)胞膜包覆的CCM-Hb-TiO_2/RRx-001,可增加其在MCF-7腫瘤中的積聚,在超聲下協(xié)同增加RONS,實(shí)現(xiàn)基于Hb的聲療和化療聯(lián)合,顯著增強(qiáng)抗瘤活性;且生物安全性較好,具有很好的臨床應(yīng)用前景。
【圖文】：

SDT作用機(jī)制[14]

RRx-001的作用機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2639961