【摘要】：腦出血在臨床上屬于常見(jiàn)病、多發(fā)病,它是指由多種原因?qū)е履X血管破裂而引起的腦實(shí)質(zhì)出血,據(jù)統(tǒng)計(jì),腦卒中是全球中老年人死亡和致殘的主要原因之一,已經(jīng)上升為世界第二大死亡原因,每年大約有1 600萬(wàn)人首次腦卒中發(fā)生,導(dǎo)致近600萬(wàn)人死亡,其中腦出血占全部腦卒中的10%~30%[1]。雖然腦出血的發(fā)病率低于腦梗死,但病死率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,腦出血病死率雖然有所降低,但在急性期的死亡率仍可高達(dá)30%~40%,且幸存者中僅12%~39%的患者未遺留殘疾,而大部分患者留下的后遺癥也使得其基本喪失勞動(dòng)能力,給患者的家庭造成了沉重負(fù)擔(dān)。盡管針對(duì)腦出血的研究從未駐足,但迄今為止其發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍未明確,可供臨床選擇治療腦出血的方法亦較少,仍無(wú)具體藥物或手術(shù)方法治療可顯著改善患者的預(yù)后。因此,進(jìn)一步深入研究腦出血的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治手段,探索腦出血的治療新靶點(diǎn),具有重要意義。在這項(xiàng)研究中,我們探討了V2受體拮抗劑托伐普坦對(duì)大鼠腦出血后腦水腫的作用及鐵離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響。在ICH手術(shù)后12小時(shí)、36小時(shí)和60小時(shí),通過(guò)口服強(qiáng)飼法將動(dòng)物隨機(jī)給予托伐普坦或生理鹽水。本研究采用了測(cè)量腦腫脹(%)、腦含水量(BWC)、神經(jīng)學(xué)評(píng)分、伊文思藍(lán)熒光和血腦屏障(BBB)緊密連接蛋白,來(lái)判斷托伐普坦在ICH后的效果。我們發(fā)現(xiàn)托伐普坦減輕了腦腫脹(%),減少了腦水含量在腦出血后的增加,減輕了ICH后的神經(jīng)功能缺損。更重要的是,托伐普坦組ZO-1和occludin的表達(dá)上調(diào),同時(shí)可以使MMP-9表達(dá)下調(diào),結(jié)果表明托伐普坦在大鼠腦出血后對(duì)BBB具有一定保護(hù)作用。同時(shí)體外用單一因素鐵離子模擬腦出血的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了鐵離子在低濃度時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞影響不大,但在一定濃度之后會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為托伐普坦用于治療ICH誘發(fā)的腦水腫提供了有力的數(shù)據(jù)支持。同時(shí)有必要用更加接近人體結(jié)構(gòu)的動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),來(lái)進(jìn)一步研究托伐普坦在ICH手術(shù)后的治療中的功效及機(jī)制。一、托伐普坦在大鼠腦出血后腦水腫治療中的作用研究目的以SD大鼠膠原酶腦出血ICH模型為基礎(chǔ),造模后12小時(shí),分為托伐普坦組和生理鹽水組口飼給藥,每隔24小時(shí)對(duì)大鼠給一次藥,并測(cè)量大鼠3天后的體重、BBB通透性、腦水含量(brain water content,BWC)和行為學(xué),觀察藥物托伐普坦對(duì)實(shí)驗(yàn)用大鼠在ICH后腦水腫消腫的影響。方法ICH手術(shù)前將40只大鼠隨機(jī)的劃分成2組:ICH組和sham組,ICH組32只大鼠,假手術(shù)sham組5只,其他備用。ICH組采用基底節(jié)區(qū)注射膠原酶的方法進(jìn)行ICH組的造模,假手術(shù)組組對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物只進(jìn)針而不注射膠原酶,在術(shù)后12小時(shí)后,每24小時(shí)灌胃一次,共灌胃三次,ICH組中隨機(jī)抽取16只作為給藥組,按每kg大鼠給予10mg托伐普坦(Tolvaptan)的劑量,將藥片直接溶于飲用水中進(jìn)行口飼灌胃;剩下16只作為對(duì)照組,對(duì)照組和sham組同時(shí)口飼等體積的水。在術(shù)后的第四天,對(duì)所有實(shí)驗(yàn)用的動(dòng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)角角度測(cè)試實(shí)驗(yàn)和前肢放置測(cè)試以進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試評(píng)分,然后進(jìn)行MRI核磁共振掃描來(lái)測(cè)量腦水腫體積和程度。在MRI測(cè)量完成后,在給藥組和對(duì)照組中隨機(jī)選取8只,sham組選取兩只,麻醉脫頸處死取腦測(cè)量其腦水含量BWC以測(cè)估其腦部水腫的程度,并且對(duì)剩下的6只和sham組的3只進(jìn)行伊文斯藍(lán)(evans blue,EB)滲出實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的BBB通透性。結(jié)果1.磁共振成像結(jié)果表明,通過(guò)口飼托伐普坦的實(shí)驗(yàn)大鼠的腦水腫體積得到了減小(p0.05)。并且BWC結(jié)果表明,注射托伐普坦的大鼠對(duì)比對(duì)照組大鼠,腦水含量得到減少,減輕了腦水腫。2.雖然m NSS評(píng)分測(cè)試數(shù)據(jù)和前肢放置測(cè)試數(shù)據(jù)顯示托伐普坦對(duì)于大鼠神經(jīng)功能的改善效果并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(p0.05),但是單從轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)測(cè)試數(shù)據(jù)我們可以得出托伐普坦有助于恢復(fù)大鼠在ICH后的一部分神經(jīng)功能(p0.05)。3.從EB免疫熒光和EB外滲定量的結(jié)果中來(lái)看,托伐普坦有效減少了EB染料血管外的滲出,間接表明在保持大鼠ICH后BBB完整性上托伐普坦起到了積極作用。結(jié)論口飼給予托伐普坦可有效縮小腦出血后腦水腫的體積,對(duì)腦出血后的血腦屏障具有一定的保護(hù)作用。二、托伐普坦對(duì)大鼠腦出血后血腦屏障的保護(hù)機(jī)制研究目的建立大鼠ICH模型,口飼給藥后,通過(guò)檢測(cè)BBB相關(guān)緊密連接蛋白(occludin、ZO-1)以及細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases)中MMP-9的表達(dá)情況,研究分析托伐普坦對(duì)BBB的保護(hù)效果和內(nèi)在機(jī)理。方法ICH手術(shù)前將25只大鼠隨機(jī)的劃分成2組:ICH組和sham組,ICH組20只大鼠,假手術(shù)sham組4只,其他備用。ICH組的造模過(guò)程與上一章節(jié)保持一致,在術(shù)后12小時(shí)后,ICH組中隨機(jī)抽取10只作為給藥組,剩下10只作為對(duì)照組,給藥劑量和給藥次數(shù)與上一章節(jié)保持一致,對(duì)照組和sham組同時(shí)口飼等體積的水。在術(shù)后的第三天,ICH給藥組和ICH實(shí)驗(yàn)組每組隨機(jī)選擇5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)BBB相關(guān)連的緊密蛋白(ZO-1,occludin)的表達(dá),另外再每組取5只,采用蛋白質(zhì)印跡(western blot,WB)法對(duì)ZO-1、occludin、MMP-9三種蛋白進(jìn)行定量比較。結(jié)果1.通過(guò)免疫熒光,WB兩種手段對(duì)血腫周圍的ZO-1、occludin表達(dá)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)托伐普坦可上調(diào)這兩種BBB相關(guān)緊密連接蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明托伐普坦對(duì)于維持BBB完整性具有積極作用。2.免疫熒光及WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,給藥組大鼠ICH后MMP-9表達(dá)的減少,說(shuō)明了托伐普坦對(duì)BBB具有一定的保護(hù)作用。結(jié)論盡管大鼠ICH后口飼給予V2受體拮抗劑托伐普坦對(duì)于腦水腫減輕的作用機(jī)制的研究并沒(méi)有非常深入,但從整體效應(yīng)上來(lái)看,托伐普坦對(duì)BBB起到了一定的保護(hù)效果。三、鐵離子模擬腦出血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響淺究目的以大鼠腎上腺鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元的的體外模型細(xì)胞,培養(yǎng)基中給予一定濃度的鐵離子后,48h后檢測(cè)cck8的吸光度,以檢測(cè)在一定的藥物濃度梯度下PC12的增殖情況,同時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡情況,以探究鐵離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成損傷的濃度大致范圍。方法設(shè)置硫酸亞鐵濃度為1000μM組、800μM組、400μM組、200μM組、100μM組、80μM組、50μM組、20μM組、10μM組、5μM組,control組和空白組,待細(xì)胞加藥培養(yǎng)48h后,加入CCK8檢測(cè)試劑(10μL/孔),用多功能酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定光密度值[D(450)],同時(shí)挑取1000μM組、800μM組、400μM組、200μM組、100μM組、80μM組,同樣處理48h后,用凋亡試劑盒進(jìn)行Annexin V與PI雙染,用流式細(xì)胞儀在488nm通道下檢測(cè)兩種染料的熒光信號(hào)強(qiáng)度,以區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。結(jié)果在低濃度下鐵離子對(duì)PC12的作用不太明顯,在200umol/L的濃度下即開(kāi)始凋亡,在800umol/L的濃度下即可看到肉眼可見(jiàn)的死亡。結(jié)論鐵離子在低濃度時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞作用不大,但在大于一定濃度之后會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用,造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死。
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文4 研究結(jié)果與分析4.1 托伐普坦在大鼠腦出血后腦水腫治療中的作用4.1.1 托伐普坦對(duì)大鼠 ICH 后對(duì)腦水腫的作用術(shù)后第三天，磁共振圖像分析（圖 1A，B）發(fā)現(xiàn)，給藥組有效減小了水腫體積(tolvaptan vs vehicle p < 0.05)。同時(shí)，腦水含量的測(cè)量顯示（圖 1C），托伐普坦可減輕患側(cè)半球腦水含量(tolvaptan vs vehicle ，p < 0.05)，，而非患側(cè)半球腦水含量實(shí)驗(yàn)組組與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tolvaptan vs vehicle，p > 0.05)

圖 2 行為學(xué)結(jié)果4.1.3 伊文斯藍(lán)(Evans blue, EB)滲出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3 示，術(shù)后第 3 天，EB 熒光法觀察血腦屏障完整性實(shí)驗(yàn)和 EB 外滲定量法測(cè)量 BBB 完整性實(shí)驗(yàn)都提示給藥組有效減小了 EB 染料血管外滲出(p < 0.05)。提示托伐普坦在大鼠 ICH 后保護(hù) BBB 完整性上有積極作用。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：2639661