【摘要】：腦出血在臨床上屬于常見病、多發(fā)病,它是指由多種原因導致腦血管破裂而引起的腦實質出血,據(jù)統(tǒng)計,腦卒中是全球中老年人死亡和致殘的主要原因之一,已經(jīng)上升為世界第二大死亡原因,每年大約有1 600萬人首次腦卒中發(fā)生,導致近600萬人死亡,其中腦出血占全部腦卒中的10%~30%[1]。雖然腦出血的發(fā)病率低于腦梗死,但病死率卻遠遠高于后者。隨著醫(yī)學技術的進步,腦出血病死率雖然有所降低,但在急性期的死亡率仍可高達30%~40%,且幸存者中僅12%~39%的患者未遺留殘疾,而大部分患者留下的后遺癥也使得其基本喪失勞動能力,給患者的家庭造成了沉重負擔。盡管針對腦出血的研究從未駐足,但迄今為止其發(fā)生發(fā)展機制仍未明確,可供臨床選擇治療腦出血的方法亦較少,仍無具體藥物或手術方法治療可顯著改善患者的預后。因此,進一步深入研究腦出血的發(fā)生發(fā)展機制及防治手段,探索腦出血的治療新靶點,具有重要意義。在這項研究中,我們探討了V2受體拮抗劑托伐普坦對大鼠腦出血后腦水腫的作用及鐵離子對神經(jīng)細胞的影響。在ICH手術后12小時、36小時和60小時,通過口服強飼法將動物隨機給予托伐普坦或生理鹽水。本研究采用了測量腦腫脹(%)、腦含水量(BWC)、神經(jīng)學評分、伊文思藍熒光和血腦屏障(BBB)緊密連接蛋白,來判斷托伐普坦在ICH后的效果。我們發(fā)現(xiàn)托伐普坦減輕了腦腫脹(%),減少了腦水含量在腦出血后的增加,減輕了ICH后的神經(jīng)功能缺損。更重要的是,托伐普坦組ZO-1和occludin的表達上調,同時可以使MMP-9表達下調,結果表明托伐普坦在大鼠腦出血后對BBB具有一定保護作用。同時體外用單一因素鐵離子模擬腦出血的實驗說明了鐵離子在低濃度時對神經(jīng)細胞影響不大,但在一定濃度之后會產(chǎn)生細胞毒性作用。實驗結果為托伐普坦用于治療ICH誘發(fā)的腦水腫提供了有力的數(shù)據(jù)支持。同時有必要用更加接近人體結構的動物的實驗數(shù)據(jù),來進一步研究托伐普坦在ICH手術后的治療中的功效及機制。一、托伐普坦在大鼠腦出血后腦水腫治療中的作用研究目的以SD大鼠膠原酶腦出血ICH模型為基礎,造模后12小時,分為托伐普坦組和生理鹽水組口飼給藥,每隔24小時對大鼠給一次藥,并測量大鼠3天后的體重、BBB通透性、腦水含量(brain water content,BWC)和行為學,觀察藥物托伐普坦對實驗用大鼠在ICH后腦水腫消腫的影響。方法ICH手術前將40只大鼠隨機的劃分成2組:ICH組和sham組,ICH組32只大鼠,假手術sham組5只,其他備用。ICH組采用基底節(jié)區(qū)注射膠原酶的方法進行ICH組的造模,假手術組組對實驗動物只進針而不注射膠原酶,在術后12小時后,每24小時灌胃一次,共灌胃三次,ICH組中隨機抽取16只作為給藥組,按每kg大鼠給予10mg托伐普坦(Tolvaptan)的劑量,將藥片直接溶于飲用水中進行口飼灌胃;剩下16只作為對照組,對照組和sham組同時口飼等體積的水。在術后的第四天,對所有實驗用的動物進行轉角角度測試實驗和前肢放置測試以進行行為學測試評分,然后進行MRI核磁共振掃描來測量腦水腫體積和程度。在MRI測量完成后,在給藥組和對照組中隨機選取8只,sham組選取兩只,麻醉脫頸處死取腦測量其腦水含量BWC以測估其腦部水腫的程度,并且對剩下的6只和sham組的3只進行伊文斯藍(evans blue,EB)滲出實驗來檢測實驗動物的BBB通透性。結果1.磁共振成像結果表明,通過口飼托伐普坦的實驗大鼠的腦水腫體積得到了減小(p0.05)。并且BWC結果表明,注射托伐普坦的大鼠對比對照組大鼠,腦水含量得到減少,減輕了腦水腫。2.雖然m NSS評分測試數(shù)據(jù)和前肢放置測試數(shù)據(jù)顯示托伐普坦對于大鼠神經(jīng)功能的改善效果并未達到統(tǒng)計學上的差異(p0.05),但是單從轉角實驗測試數(shù)據(jù)我們可以得出托伐普坦有助于恢復大鼠在ICH后的一部分神經(jīng)功能(p0.05)。3.從EB免疫熒光和EB外滲定量的結果中來看,托伐普坦有效減少了EB染料血管外的滲出,間接表明在保持大鼠ICH后BBB完整性上托伐普坦起到了積極作用。結論口飼給予托伐普坦可有效縮小腦出血后腦水腫的體積,對腦出血后的血腦屏障具有一定的保護作用。二、托伐普坦對大鼠腦出血后血腦屏障的保護機制研究目的建立大鼠ICH模型,口飼給藥后,通過檢測BBB相關緊密連接蛋白(occludin、ZO-1)以及細胞基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases)中MMP-9的表達情況,研究分析托伐普坦對BBB的保護效果和內在機理。方法ICH手術前將25只大鼠隨機的劃分成2組:ICH組和sham組,ICH組20只大鼠,假手術sham組4只,其他備用。ICH組的造模過程與上一章節(jié)保持一致,在術后12小時后,ICH組中隨機抽取10只作為給藥組,剩下10只作為對照組,給藥劑量和給藥次數(shù)與上一章節(jié)保持一致,對照組和sham組同時口飼等體積的水。在術后的第三天,ICH給藥組和ICH實驗組每組隨機選擇5只實驗動物進行免疫熒光染色檢測BBB相關連的緊密蛋白(ZO-1,occludin)的表達,另外再每組取5只,采用蛋白質印跡(western blot,WB)法對ZO-1、occludin、MMP-9三種蛋白進行定量比較。結果1.通過免疫熒光,WB兩種手段對血腫周圍的ZO-1、occludin表達檢測,發(fā)現(xiàn)托伐普坦可上調這兩種BBB相關緊密連接蛋白表達,實驗結果表明托伐普坦對于維持BBB完整性具有積極作用。2.免疫熒光及WB實驗結果說明,給藥組大鼠ICH后MMP-9表達的減少,說明了托伐普坦對BBB具有一定的保護作用。結論盡管大鼠ICH后口飼給予V2受體拮抗劑托伐普坦對于腦水腫減輕的作用機制的研究并沒有非常深入,但從整體效應上來看,托伐普坦對BBB起到了一定的保護效果。三、鐵離子模擬腦出血對神經(jīng)細胞的影響淺究目的以大鼠腎上腺鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞作為神經(jīng)元的的體外模型細胞,培養(yǎng)基中給予一定濃度的鐵離子后,48h后檢測cck8的吸光度,以檢測在一定的藥物濃度梯度下PC12的增殖情況,同時用流式細胞儀檢測其凋亡情況,以探究鐵離子對神經(jīng)細胞造成損傷的濃度大致范圍。方法設置硫酸亞鐵濃度為1000μM組、800μM組、400μM組、200μM組、100μM組、80μM組、50μM組、20μM組、10μM組、5μM組,control組和空白組,待細胞加藥培養(yǎng)48h后,加入CCK8檢測試劑(10μL/孔),用多功能酶標儀在波長450nm處測定光密度值[D(450)],同時挑取1000μM組、800μM組、400μM組、200μM組、100μM組、80μM組,同樣處理48h后,用凋亡試劑盒進行Annexin V與PI雙染,用流式細胞儀在488nm通道下檢測兩種染料的熒光信號強度,以區(qū)分凋亡和壞死細胞。結果在低濃度下鐵離子對PC12的作用不太明顯,在200umol/L的濃度下即開始凋亡,在800umol/L的濃度下即可看到肉眼可見的死亡。結論鐵離子在低濃度時對神經(jīng)細胞作用不大,但在大于一定濃度之后會產(chǎn)生細胞毒性作用,造成神經(jīng)細胞的凋亡和壞死。
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西南大學碩士學位論文4 研究結果與分析4.1 托伐普坦在大鼠腦出血后腦水腫治療中的作用4.1.1 托伐普坦對大鼠 ICH 后對腦水腫的作用術后第三天，磁共振圖像分析（圖 1A，B）發(fā)現(xiàn)，給藥組有效減小了水腫體積(tolvaptan vs vehicle p < 0.05)。同時，腦水含量的測量顯示（圖 1C），托伐普坦可減輕患側半球腦水含量(tolvaptan vs vehicle ，p < 0.05)，，而非患側半球腦水含量實驗組組與對照組間無統(tǒng)計學差異(tolvaptan vs vehicle，p > 0.05)

圖 2 行為學結果4.1.3 伊文斯藍(Evans blue, EB)滲出實驗結果如圖 3 示，術后第 3 天，EB 熒光法觀察血腦屏障完整性實驗和 EB 外滲定量法測量 BBB 完整性實驗都提示給藥組有效減小了 EB 染料血管外滲出(p < 0.05)。提示托伐普坦在大鼠 ICH 后保護 BBB 完整性上有積極作用。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R965

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