發(fā)布時間：2020-04-23 23:26

【摘要】：研究目的1)制備肝癌靶向、還原敏感型、載有超順磁性氧化鐵(SPIO)及抗癌藥物阿霉素(DOX)的診療一體化納米膠束(HA-SS-PCL@DOX/SPIO)并對其理化性質進行體外表征。2)通過體外細胞實驗,探討空白膠束(HA-SS-PCL)的安全性及載藥膠束(HA-SS-PCL@DOX/SPIO)的細胞毒性、體外DOX釋放效應,以及利用MRI對載藥膠束抗癌藥物靶向傳遞進行監(jiān)測的可行性。3)通過體內(nèi)動物實驗,探討載藥膠束(HA-SS-PCL@DOX/SPIO)對裸小鼠人肝癌HepG_2細胞移植瘤的急性毒副作用,主動靶向性、還原敏感性以及利用MRI對其進行無創(chuàng)、實時、動態(tài)監(jiān)測的可行性。研究方法1)納米膠束(HA-SS-PCL@DOX/SPIO)的制備及表征:a)首先通過己內(nèi)酯(ε-CL)的開環(huán)聚合反應,在十二醇引發(fā)劑的作用下,制備出聚己內(nèi)酯(PCL);然后經(jīng)過兩步化學反應將PCL的端羥基轉化成含有二硫鍵鏈接的氨基(PCL-SS-NH_2);然后以PCL-SS-NH_2為大分子引發(fā)劑,通過疊氮化谷氨酸酯環(huán)內(nèi)酸酐(AELG-NCA)單體聚合成功制備出含二硫鍵的嵌段聚合物PCL-SS-PAELG;最后,通過“Click”反應,將炔基化透明質酸(HA)偶聯(lián)到所合成的共聚物,形成HA-SS-PCL。最后,通過透析法將超順磁性氧化鐵(SPIO)、抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)高效負載于聚合物疏水性內(nèi)核中。b)聚合物膠束理化性質表征包括:通過~1HNMR、FTIR表征聚合物HA-SS-PCL合成;利用動態(tài)光散射(DLS)和透射電鏡(TEM)測量膠束粒徑大小、形態(tài)及分布;采用芘熒光法檢測臨界膠束濃度;利用原子吸收法測量SPIO的負載率,利用紫外吸收法測量DOX包封率,并對膠束體外DOX釋放進行測定。2)體外細胞實驗a)利用四唑鹽比色法(MTT)考察空白膠束HA-SS-PCL的安全性及載藥膠束HA-SS-PCL@DOX/SPIO的細胞毒性。b)將Free DOX、HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO納米膠束分別與人肝癌HepG_2細胞共孵育后,分別進行熒光顯微鏡、流式細胞術及DAPI染色,從體外細胞水平觀察載藥膠束HA-SS-PCL@DOX/SPIO對人肝癌HepG_2細胞主動靶向機制。c)通過體外細胞MRI成像,觀察載藥膠束HA-SS-PCL@DOX/SPIO T_2WI信號強度變化情況,探索MRI評價人肝癌HepG_2細胞對納米膠束吸收的可行性。3)體內(nèi)動物實驗a)建立裸小鼠人肝癌皮下移植瘤動物模型,約4~6周當腫瘤直徑達1~2cm時,按分組要求,將21只裸鼠隨機分成生理鹽水組、HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO組,每組7只,實驗組經(jīng)尾靜脈按Fe 0.5 mg/kg注射膠束,對照組經(jīng)尾靜脈注射同等量的生理鹽水,注射前及注射后不同時點(2 h、4 h、8 h)分別進行MRI成像,測量感興趣區(qū)(腫瘤)T_2WI信號強度、T_2值及T_1值,計算信號變化率。不同掃描時間點各組分別后處死一只裸鼠,行常規(guī)HE染色和普魯士藍染色。b)建立裸小鼠人肝癌肝內(nèi)原位移植瘤動物模型,約4~6周當腫瘤直徑達0.5~1.5cm時,按分組要求,將12只裸鼠隨機分成生理鹽水組、HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO組,每組4只,實驗組連續(xù)3次間隔一天經(jīng)尾靜脈按DOX 2 mg/kg注射藥物膠束,對照組經(jīng)尾靜脈注射同等量生理鹽水。最后一次注射藥物后24 h后處死裸鼠,行常規(guī)HE染色和普魯士藍染色。結果1)~1HNMR和FTIR證實聚合物納米膠束HA-SS-PCL制備成功。DLS和TEM顯示所制備的膠束符合納米尺寸、均勻性好。紫外吸收法及原子吸收法分別顯示DOX及SPIO負載效率高。體外釋放實驗證實HA-SS-PCL@DOX/SPIO對DOX的釋放具有很好的緩釋。2)體外細胞實驗a)MTT試驗顯示一定濃度下的空白膠束HA-SS-PCL對HepG_2及LO_2細胞均有較好的相容性,安全性可。b)MTT試驗顯示載藥膠束HA-SS-PCL@DOX/SPIO對DOX具有良好的釋放,隨著負載DOX濃度的升高,對HepG_2細胞殺傷力逐漸升高。c)熒光觀察、DAPI染核以及流式細胞分析結果顯示:Free DOX、HA-PCL@DOX/SPIO及HA-SS-PCL@DOX/SPIO組熒光強度存在顯著差異;Free DOX組熒光最強、HA-SS-PCL@DOX/SPIO次之,HA-PCL@DOX/SPIO最弱。d)體外MRI成像顯示HA-SS-PCL@DOX/SPIO組及HA-PCL@DOX/SPIO組其T_2WI信號強度明顯低于空白對照組,而HA-SS-PCL@DOX/SPIO組較HA-PCL@DOX/SPIO組其T_2WI信號強度下降更為明顯。3)動物實驗a)成功建立了裸小鼠荷人肝癌皮下異位移植瘤動物模型及肝內(nèi)原位移植瘤動物模型,HE染色證實其符合肝細胞癌模型。b)動物MRI成像顯示:注射納米膠束HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO后腫瘤組織2 h、4 h其T_2WI強度較平掃時均有明顯下降,后者下降更為顯著。注射納米膠束HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO后腫瘤組織2 h、4 h、8 h其T_2值較平掃時均有明顯下降,后者下降更為顯著。注射納米膠束HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO后腫瘤組織各時間點其T_1值較平掃時均未見明顯下降。c)普魯士藍染色證實不同時間點HA-SS-PCL@DOX/SPIO組腫瘤組織內(nèi)見較多的藍染的Fe顆粒,HA-PCL@DOX/SPIO組見較少的藍染的Fe顆粒存在,以2 h為著,而生理鹽水組未見藍染的Fe顆粒存在。同時,結果進一步證實HA-SS-PCL@DOX/SPIO膠束主要集中分布于腫瘤組織內(nèi),其它臟器極少或無分布。結論1)本研究成功制備了一種新型肝癌靶向診療一體化的還原敏感型嵌段聚合物納米膠束HA-SS-PCL@DOX/SPIO。2)制備的納米膠束HA-SS-PCL@DOX/SPIO粒徑小,大小均一,具有良好的水溶性、生物相容性、抗腫瘤效應,主動靶向性、強還原敏感型及MRI顯像等多種功能于一體,具有較好的潛在應用前景。
【圖文】：

其間每天添加 20 mg 的氰基硼氫化鈉。反應結束后用透析的方法進行提純，，冷凍干燥得到白色產(chǎn)物 2.7 g，產(chǎn)率為 91%。由于透明質酸鈉不能在 DMSO 中溶解，為了能夠與 α-alkyne PZLL 進行點擊反應，需要先用鹽酸對透明質酸鈉進行酸化處理。1.1.3.3 兩親性嵌段聚合物 HA-SS-PCL 的合成按照圖 1-1（c）所示合成 HA-SS-PCL。具體步驟如下：首先將 0.22 g HA-N3（0.54mmol）與 0.1 g alkyne-SS-PCL 溶于 10 ml DMSO 中，并通入氬氣驅走氧氣。加入 15 mg CuSO4.5H2O，繼續(xù)通入氬氣 10 min，后加入 30 mg 抗壞血酸鈉（NaAsc）。然后，將燒瓶在氬氣下密封，并在 40℃的油浴中浸泡 3 天后將反應介質轉移至截留分子量為 3.5 kD（MWCO）的透析膜，首先針對乙二胺四乙酸（EDTA）透析 3 天，然后針對純水透析 3 天，以除去銅和抗壞血酸鹽以及過量炔丙基乳糖。最后，經(jīng)過透析與凍干，得到白色固體的最終產(chǎn)物 HA-SS-PCL（產(chǎn)量：0.146g，82％）。

1HNMR 表征圖1-2 代表 α-alkyne-SS-PCL三種濃度的1H NMR譜圖。α-alkyne-SS-PCL上的H質子峰如下：4.69 ppm (HC≡CCH2O-), 4.12～4.01 ppm(-COOCH2CH2-), 3.64 ppm(-NHCH2CH2-), 2.81 ～ 2.79 ppm (-CH2SSCH2-), 1.73 ～ 1.58 ppm(-COOCH2CH2CH2CH2CH2-) ，2.36～2.24 ppm (-CH2CH2COO-)，1.41～1.32 ppm(-COOCH2CH2CH2CH2CH2-)證明α-alkyne-SS-PCL已成功制備。圖1-3 代表 HA-SS-PCL的1HNMR譜圖。點擊反應所生成的三唑環(huán)上質子峰出在7.6 ppm處（f），說明HA-N3與α-alkyne-SS-PCL在炔基上發(fā)生了化學反應，形成了新的化學鍵，表明HA-SS-PCL接枝共聚物已經(jīng)成功合成。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943

【參考文獻】

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1 祁春梅;馬根山;劉乃豐;陳忠;沈成興;劉孝鈞;胡耀鵬;蘇亞民;李璇;滕皋軍;居勝紅;張曉黎;顧寧;;磁探針標記骨髓干細胞移植治療急性心肌梗死的MRI示蹤研究[J];中華醫(yī)學雜志;2007年22期

本文編號：2638271