【摘要】：順鉑(Cisplatin)是一個典型的化療藥物并廣泛用于治療不同類型的實體瘤中,包括卵巢和頭頸部,睪丸和子宮頸等部位的癌癥。但是,順鉑常常引起急性藥源性腎病,表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞的損傷、血肌酐、尿素氮等的升高,明顯降低腫瘤患者的生存率。眾所周知,傳統(tǒng)中藥在治療疾病時高效低毒,尤其是青蒿素治療瘧疾的成功運(yùn)用,更堅定了人們對傳統(tǒng)中藥的研究。本課題組通過查閱文獻(xiàn),初步選出十種具有抗炎作用的中藥單體,包括蘆薈素、淫羊藿苷、原兒茶醛、原兒茶酸、葛根素等,結(jié)果發(fā)現(xiàn),從傳統(tǒng)中藥唇形科植物丹參根部提取的中藥單體原兒茶醛(Protocatechuic Aldehyde,PA)對順鉑引起的腎臟損傷可能具有治療作用。本課題進(jìn)一步檢測原兒茶醛對順鉑引起急性腎損傷的保護(hù)作用并探索其作用機(jī)制,為防治急性腎損傷尋找潛在新靶點(diǎn)。課題主要從體內(nèi)體外兩方面展開,具體研究分為以下幾部分:1.原兒茶醛減輕順鉑介導(dǎo)的急性腎臟損傷體內(nèi)實驗,順鉑腹腔注射建立急性腎損傷模型,分別給予原兒茶醛(0.45,0.9,和1.8 mg/kg)治療,觀察并對比模型組小鼠腎臟功能、腎小管形態(tài)學(xué)變化及腎臟損傷因子KIM1表達(dá)變化;通過PAS染色和尿NGAL和血肌酐尿素氮檢測發(fā)現(xiàn)原兒茶醛可以降低順鉑引起的腎臟功能損傷以及形態(tài)學(xué)變化,同時這一結(jié)果在KIM1的蛋白印跡和免疫組化中證實;體外實驗,以HK2細(xì)胞為實驗對象,首先使用MTT實驗觀察原兒茶醛對順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用,選出有效劑量,并對比觀察模型組KIM1表達(dá)變化;結(jié)果顯示,原兒茶醛在濃度為0.25,0.5,1 uM時,可以顯著減輕順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞死亡和KIM1表達(dá);2.原兒茶醛減輕順鉑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)體內(nèi)實驗,使用real-time PCR和IHC檢測相關(guān)炎癥因子表達(dá),結(jié)果顯示原兒茶醛減輕急性腎損傷小鼠炎癥反應(yīng);體外實驗中,Real-time PCR和Elisa等方法,再次證實原兒茶醛降低順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng);3.原兒茶醛減輕順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡體內(nèi)實驗,使用Western blot方法檢測細(xì)胞程序性死亡相關(guān)通路蛋白變化,結(jié)果顯示原兒茶醛減輕急性腎損傷小鼠凋亡壞死水平;體外實驗中,流式細(xì)胞術(shù)和Western blot方法,進(jìn)一步驗證了原兒茶醛減輕順鉑介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的作用;4.原兒茶醛減輕順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激體內(nèi)實驗,使用GSH和MDA試劑盒以及IHC,Western blot方法檢測Nox2和Nox4表達(dá),觀察氧化應(yīng)激變化;體外實驗,通過DCF和DHE試劑熒光染色觀察氧化應(yīng)激的變化;同時觀察NADPH阻斷劑APO對原兒茶醛治療效果的影響,并進(jìn)一步構(gòu)建Nox2沉默細(xì)胞株和Nox4沉默細(xì)胞株,探索其作用機(jī)制。結(jié)果提示,原兒茶醛可以降低由順鉑引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激水平;同時,早期研究以及本課題發(fā)現(xiàn)APO或PA可以降低Cisplatin引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷。但是,本實驗使用NADPH抑制劑即APO后,PA不再發(fā)揮治療其作用。因而,猜測NADPH可能是原兒茶醛治療急性腎損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。于是,進(jìn)一步分析在腎臟中表達(dá)較高的Nox相關(guān)蛋白(Nox2和Nox4),并構(gòu)建Nox2和Nox4沉默細(xì)胞株。在Nox2沉默細(xì)胞株中,原兒茶醛進(jìn)一步減輕順鉑誘導(dǎo)的KIM1表達(dá);但是,在Nox4沉默細(xì)胞株中,原兒茶醛不再發(fā)揮治療其作用。由此證明,原兒茶醛對順鉑引起的急性腎損傷的治療作用可能是以Nox4為作用靶點(diǎn)。另一方面,體內(nèi)通過尾靜脈注射慢病毒在體沉默Nox4,對比模型組,沉默Nox4減輕順鉑引起的腎小管形態(tài)學(xué)損傷,進(jìn)一步提示Nox4可能是順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的重要防治靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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本文編號：2637081