【摘要】：第一部分興奮劑檢測中區(qū)分克侖特羅來源的研究克侖特羅是世界反興奮劑機(jī)構(gòu)明確列入禁用物質(zhì)清單的蛋白同化制劑,它在臨床上主要用于治療哮喘。由于其具有較強(qiáng)的蛋白同化作用,又較容易合成,因此,在畜牧業(yè)中又被濫用為飼料添加劑用于增加養(yǎng)殖動物的瘦肉脂肪比,俗稱“瘦肉精”。而由克侖特羅飼喂過的動物,會在其肌肉及內(nèi)臟組織中殘留,因而會引起二次污染甚至中毒的問題。運動員如果食用了被克侖特羅污染的肉食品有可能引起興奮劑尿檢陽性。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(World Anti-Doping Agency,WADA)報告檢測結(jié)果的ADAMS系統(tǒng)中克侖特羅的陽性率也呈逐年明顯上升趨勢,全球范圍內(nèi)的克侖特羅陽性均有明顯增加�？藖鎏亓_在肉食品中的殘留污染問題不僅在我國存在,世界其他很多國家,比如意大利、墨西哥、西班牙、葡萄牙和法國等都曾報道過克侖特羅在肉食品中的污染或中毒事件。因此,“如何在興奮劑檢測層面上區(qū)分食源性和藥源性克侖特羅?”是一個國際體育界難題。由于克侖特羅化學(xué)結(jié)構(gòu)中有一個手性碳,因此,它存在一對光學(xué)異構(gòu)體,即R-(-)-克侖特羅和S-(+)-克侖特羅。但目前市售的克侖特羅均為外消旋體(即R/S比值等于1),其中有活性的是R-(-)-克侖特羅。早在2000年時,就有文獻(xiàn)報道,克侖特羅的兩種光學(xué)異構(gòu)體在豬體內(nèi)可食性組織中的殘留存在差異,R/S比值小于1。因此,本論文以此為切入點,以中國運動員食用量最大的豬肉作為研究對象,探討食源和藥源克侖特羅的區(qū)分方法。目的:建立通過興奮劑檢測的方式區(qū)分食源性和藥源性克侖特羅的方法,意在為誤食被克侖特羅污染的肉食品而引發(fā)興奮劑尿檢陽性的運動員提供科學(xué)數(shù)據(jù)支持。方法:采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS),建立了血、尿以及組織中R型和S型克侖特羅兩種異構(gòu)體的區(qū)分方法并完成方法學(xué)驗證。應(yīng)用該方法,研究兩種異構(gòu)體在巴馬豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)及組織分布,并對26位受試志愿者分別進(jìn)行人體食源性中豬肉來源和藥源性克侖特羅的尿液代謝研究。通過對兩組人體受試實驗數(shù)據(jù)的分析,最終尋找區(qū)分食源中豬肉源和藥源克侖特羅的判定依據(jù)。本文建立的血、尿和組織中區(qū)分R-(-)-克侖特羅和S-(+)-克侖特羅的檢測方法,經(jīng)方法學(xué)驗證后均符合藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(2014版)和WADA頒布的實驗室國際標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果:對巴馬豬灌胃給藥外消旋體克侖特羅后,其血中R/S比值均大于1,其尿液中R/S比值均小于1,其可食性肌肉組織中殘留的R/S比值均小于1。對26位受試志愿者分別進(jìn)行食源性克侖特羅和藥源性克侖特羅人體受試,食源性克侖特羅經(jīng)人體代謝后,其尿液中R/S比值為0.76±0.09,即0.67～0.85;藥源性克侖特羅經(jīng)人體代謝后,其尿液中R/S比值為1.09±0.07,即1.02～1.16。采用雙邊T檢驗對兩組尿液中克侖特羅的R/S比值進(jìn)行統(tǒng)計分析,結(jié)果存在顯著性差異。結(jié)論:通過上述研究結(jié)果,可以得出以下R/S比值判定參考:(1)當(dāng)運動員尿樣中R/S比值大于等于0.67且小于等于0.85時,判斷其為豬肉來源的克侖特羅;(2)當(dāng)R/S比值大于0.85且小于1.02時,需要運動員提供食源性引入克侖特羅的其他證據(jù),進(jìn)一步確定其為豬肉來源;(3)當(dāng)R/S比值大于等于1.02且小于等于1.16時,可以判斷其為藥源性來源克侖特羅;(4)當(dāng)R/S比值小于0.67或大于1.16時,可以判斷為非藥源性克侖特羅,但需要進(jìn)一步調(diào)查是否攝入其他來源的肉食品,如牛、羊等。本文建立的區(qū)分食源性和藥源性克侖特羅的方法,將為誤食被克侖特羅污染的肉食品而引發(fā)興奮劑尿檢陽性的運動員提供科學(xué)的判定依據(jù)。第二部分興奮劑檢測中甲基屈他雄酮人尿代謝產(chǎn)物研究在倫敦奧運周期(2012～2016年)中,興奮劑檢測技術(shù)上的最大進(jìn)步,就是關(guān)于甾體類蛋白同化制劑長效代謝產(chǎn)物的研究。在2008年北京奧運會和2012年倫敦奧運會中,運動員尿樣復(fù)檢結(jié)果中報告陽性例數(shù)最多的也是長效代謝產(chǎn)物。因此,研究甾體類蛋白同化制劑在人尿中的長效代謝產(chǎn)物是目前興奮劑檢測領(lǐng)域的熱點問題。甲基屈他雄酮是世界反興奮劑機(jī)構(gòu)在禁用物質(zhì)清單中明確列出的甾體類蛋白同化制劑,它是目前未被研究的長效代謝產(chǎn)物中陽性較高的甾體類蛋白同化制劑之一。目的:通過對人體口服甲基屈他雄酮后的尿液分析,尋找其尿液中的長效代謝產(chǎn)物,以延長興奮劑檢測的時間窗口。方法:本研究首先通過LC-QTOF-MS中準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和子離子掃描特征碎片尋找尿液中結(jié)合型代謝產(chǎn)物:葡萄糖醛酸結(jié)合型代謝產(chǎn)物(用G表示)和硫酸酯結(jié)合性代謝產(chǎn)物(用S表示);對不同保留時間流份前處理后GC-MS分析,推測代謝產(chǎn)物游離部分的甾環(huán)取代結(jié)構(gòu);針對游離型代謝產(chǎn)物再直接采取衍生化進(jìn)行GC-MS分析,推測其結(jié)構(gòu)。結(jié)果:對健康成人受試志愿者進(jìn)行單劑量口服甲基屈他雄酮后的尿液進(jìn)行研究時,發(fā)現(xiàn)了 15種代謝產(chǎn)物,其中6種游離型,7種G型,2種S型。并對每種代謝產(chǎn)物的檢測時長進(jìn)行了評估,所有代謝產(chǎn)物檢測窗口在3-10天,其中G1和G2的檢測窗口可達(dá)10天,為潛在的長效代謝產(chǎn)物。結(jié)論:本研究在人體口服甲基屈他雄酮后的陽性尿樣中發(fā)現(xiàn)的長效代謝產(chǎn)物,根據(jù)WADA實驗室國際標(biāo)準(zhǔn),在興奮劑檢測同一批次中可以作為質(zhì)控物質(zhì)來確認(rèn)運動員尿樣中該物質(zhì)的陽性。因此,本研究發(fā)現(xiàn)的長效代謝產(chǎn)物在興奮劑檢測領(lǐng)域具有重要的現(xiàn)實意義。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R917

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2636009