【摘要】：背景:套細(xì)胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma,MCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)中惡性程度較高的一種亞型。由于疾病早期癥狀不明顯且缺乏有效的早期診斷技術(shù),多數(shù)MCL患者在確診時(shí)已是中晚期。由于化療藥物的毒副作用和腫瘤的耐藥復(fù)發(fā)問題,MCL的五年存活率較低,所以開發(fā)高效可靠的治療手段具有十分重要的意義。主動(dòng)靶向藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是腫瘤治療的研究熱點(diǎn),選擇合適的載體材料及發(fā)現(xiàn)高特異性的靶向配體是實(shí)現(xiàn)腫瘤主動(dòng)靶向治療的關(guān)鍵。金納米顆粒(Au NPs)具備優(yōu)異的物化特性、表面可修飾性和生物安全性,常用于光動(dòng)力學(xué)治療、光熱治療、成像和藥物遞送等。腫瘤靶向多肽是一類對(duì)腫瘤組織或細(xì)胞具有靶向選擇性的低分子量多肽,在腫瘤診療領(lǐng)域中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。本課題擬構(gòu)建一種以Jeko-1細(xì)胞(套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞)靶向多肽和Au NPs為基礎(chǔ)的主動(dòng)靶向系統(tǒng),并對(duì)其靶向選擇性和藥物靶向轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行研究。方法:首先通過檸檬酸鈉還原法制備Au NPs,然后應(yīng)用α-巰基-ω-羧基聚乙二醇(HS-PEG-COOH)對(duì)Au NPs表面進(jìn)行羧基化改性,再利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)催化的酯化反應(yīng)(EDC/NHS反應(yīng))將異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的特異性多肽TUZG12和多柔比星(Doxorubicin,DOX)偶聯(lián)于Au NPs表面,制備靶向多肽修飾的載藥Au NPs。采用紫外可見光譜掃描、粒徑分析和瓊脂糖凝膠電泳等手段對(duì)Au NPs的表面修飾情況進(jìn)行表征。將靶向多肽修飾的載藥Au NPs分別與淋巴瘤細(xì)胞Jeko-1(靶細(xì)胞)、Granta-519和正常人淋巴細(xì)胞(兩種陰性對(duì)照細(xì)胞)作用,利用免疫熒光鑒定上述Au NPs的靶向選擇性和藥物靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的效果。MTT法考察靶向多肽修飾的載藥Au NPs對(duì)Jeko-1的靶向細(xì)胞殺傷作用。最后利用免疫磁珠、SDS-PAGE和質(zhì)譜等方法對(duì)多肽TUZG12與Jeko-1細(xì)胞特異性結(jié)合的靶分子進(jìn)行了初步的分離和鑒定。結(jié)果:研究結(jié)果表明所制備的Au NPs平均粒徑約為28 nm。經(jīng)過一系列修飾反應(yīng)后,Au NPs的平均粒徑、紫外可見吸收光譜和瓊脂糖凝膠電泳行為等方面都發(fā)生了相應(yīng)的改變,說明Au NPs表面極有可能成功修飾上了多肽和DOX。通過免疫熒光檢測(cè),靶向多肽修飾的Au NPs與Jeko-1細(xì)胞作用后存在較強(qiáng)的綠色熒光,而正常人淋巴細(xì)胞和Granta-519細(xì)胞則在相同條件下幾乎沒有檢測(cè)到綠色熒光。在Jeko-1細(xì)胞中,僅有靶向多肽修飾的載藥Au NPs組同時(shí)檢測(cè)到明顯的紅色和綠色熒光,其它載藥Au NPs組僅檢測(cè)到微弱的紅色熒光。相比于其它載藥Au NPs組,靶向多肽修飾的載藥Au NPs組的Jeko-1細(xì)胞的活性更低。采用SDS-PAGE對(duì)靶向多肽組與非靶向多肽組的磁珠蛋白捕獲物進(jìn)行了分離,差異蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定,表明靶向多肽與Jeko-1細(xì)胞作用的靶分子可能是PYM1(Partner of Y14 and mago)。結(jié)論:本課題以AuNPs、多肽TUZG12和DOX為基礎(chǔ)構(gòu)建了Jeko-1靶向的Au NPs復(fù)合體。研究結(jié)果該Au NPs復(fù)合體對(duì)Jeko-1細(xì)胞具有較強(qiáng)的靶向選擇性和良好的靶向細(xì)胞殺傷作用。PYM1蛋白可能是多肽TUZG12與Jeko-1細(xì)胞作用的潛在靶分子。
【圖文】：

套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞 Jeko-1 靶向多肽修飾的載藥納米金復(fù)合體的構(gòu)建及其研究展示系統(tǒng)[22]（圖 1.1）。相比于其它的多肽篩選手段，噬菌體展示技術(shù)具有多個(gè)優(yōu)勢(shì)：（1）具有龐大的多肽展示庫；（2）高效、已商業(yè)化、成本低、實(shí)驗(yàn)條件要求低、多肽大小和形態(tài)多樣性；（3）可進(jìn)行體內(nèi)外篩選；（4）篩選前可進(jìn)行化學(xué)修飾等。

圖 2.1AuNPs 粒徑分布圖Figure 2.1 Size distribution ofAuNPs.2AuNPs 的微觀形態(tài)利用高分辨率透射電子顯微鏡成像技術(shù)來觀察自制 AuNPs 的微觀形態(tài)和。結(jié)果如圖 2.2 所示，可見自制 AuNPs 呈類球狀，顆粒的形態(tài)和大小分布均一，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，平均粒徑大小為 21 ± 1.9 nm（這是顆粒的真實(shí)粒徑般比 DLS 激光粒度儀所得水合粒徑值��；后面顆粒粒徑的大小均用 DLS 激度儀所得水合粒徑值表示）。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R943

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2635178