發(fā)布時間：2020-04-16 17:48

【摘要】：金黃色葡萄球菌在自然界中分布廣泛,是院內(nèi)感染的主要病原菌,能引起多種嚴(yán)重疾病。抗生素的發(fā)現(xiàn)是人類醫(yī)療史上的壯舉,但由于抗生素的不合理使用,使耐藥菌的出現(xiàn)層出不窮,其中包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。MRSA幾乎對所有種類的抗生素表現(xiàn)出耐藥性,唯獨對萬古霉素敏感,然而近年來甚至還發(fā)現(xiàn)了耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)。為了防止耐藥菌的治療陷入困境,需要開發(fā)一種新的方法去尋找環(huán)境中微量的抑菌活性物質(zhì)。傳統(tǒng)的藥物發(fā)掘手段主要包括生物活性導(dǎo)向篩選、化學(xué)結(jié)構(gòu)篩選和基因簇檢測,存在著開發(fā)難度大、周期長、高通量篩選樣品較為困難等缺點。為了克服這些問題,需要設(shè)計一種具有高靈敏度、高重復(fù)性、操作簡便、適用于高通量快速檢測環(huán)境樣品的報告系統(tǒng)。本研究利用金黃色葡萄球菌熱休克蛋白基因啟動子構(gòu)建了一系列l(wèi)ux報告菌株,在確認(rèn)了實驗室現(xiàn)有抗生素能夠引起報告株的發(fā)光反應(yīng)后,創(chuàng)新性地將其應(yīng)用發(fā)酵液樣品中抗生素的檢測,并初步探究了該物質(zhì)的分離純化方法。按照作用機制不同,選取了七大類共16種抗生素來檢測報告株的發(fā)光反應(yīng)。借助小動物活體成像系統(tǒng),成功捕捉到了抑菌圈周圍的生物發(fā)光。其中,環(huán)丙沙星、加替沙星、達(dá)托霉素和絲裂霉素C能引起四種報告株的強烈發(fā)光,對于不同種類的抗生素,不同報告株的發(fā)光反應(yīng)也不同。隨后利用R語言對發(fā)光信號進行定量,使結(jié)果更為直觀,并發(fā)現(xiàn)了報告株對抗生素存在三種不同的反應(yīng)類型。由于藥敏紙片法操作較為繁瑣,需要制作雙層平板且通量較小,所以本文對檢測方法做了探究和優(yōu)化。將報告株菌液加入96孔酶標(biāo)版中,然后將待測樣品加入到報告菌液里,利用酶標(biāo)儀檢測發(fā)光強度變化。最終從118株菌體發(fā)酵液中篩選出了3個能使報告株發(fā)光上調(diào)的樣品,其中63號樣品的抑菌圈最為明顯。63號樣品是一株小單孢子菌的發(fā)酵液,隨后借助凝膠色譜、反相色譜和高效液相色譜對該抗菌物質(zhì)進行分離,將其定位到了液相上的單一峰。由于該抗菌物質(zhì)產(chǎn)量較少,本文對發(fā)酵條件進行了摸索,發(fā)現(xiàn)該菌株利用LB培養(yǎng)基發(fā)酵后能產(chǎn)生更大的抑菌圈。
【圖文】：

調(diào)控，

本文編號：2629865