【摘要】：沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Sir2)酶或sirtuins是細(xì)胞內(nèi)具有β-NAD~+(或NAD~+)依賴性的蛋白N~ε-�；嚢彼崛ヵ；呋钚缘拿讣易�。這些酶在三類進(jìn)化生命體(即細(xì)菌,古菌,真核生物)中都有存在,酵母Sir2是最先發(fā)現(xiàn)的sirtuin家族成員,在人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了七個(gè)sirtuins,即SIRT1-7。蛋白賴氨酸N~ε-�；腿ヵ；谏^程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,如調(diào)節(jié)代謝,基因轉(zhuǎn)錄,神經(jīng)退行,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期進(jìn)展,衰老和細(xì)胞骨架組織。本論文工作從以下三方面對sirtuin家族進(jìn)行了研究。(1)SIRT1/2/3去�；磻�(yīng)的新底物的發(fā)展:雖然現(xiàn)已發(fā)展出不少用于體外測試的sirtuin去�；磻�(yīng)的底物,主要的都是基于直鏈肽的。由于直鏈肽一般來說能被蛋白酶/肽酶降解并且不易透過細(xì)胞膜,所以這些底物不能用于檢測細(xì)胞內(nèi)sirtuin的去�；呋钚�,甚至也不能用于檢測細(xì)胞裂解液中sirtuin的催化去�；钚浴；诒菊n題組以往成功地發(fā)展出多個(gè)sirtuin的環(huán)肽類催化機(jī)制導(dǎo)向的抑制劑,加上這類抑制劑作用機(jī)制的第一步是被sirtuin當(dāng)做底物處理,所以在本論文工作中我們挑選出其中表現(xiàn)最佳的SIRT1/2/3環(huán)肽類抑制劑作為結(jié)構(gòu)模板將其分子中的催化機(jī)制導(dǎo)向的基于賴氨酸的抑制彈頭換為N~e-�；嚢彼�,以期發(fā)展出代謝較穩(wěn)定并能透過細(xì)胞膜的強(qiáng)效且具有選擇性的SIRT1/2/3底物。這樣的底物不僅能夠像現(xiàn)有的底物一樣用以構(gòu)建sirtuin抑制劑(或激活劑)的篩選平臺(tái);當(dāng)結(jié)合使用現(xiàn)已發(fā)展出的強(qiáng)效、選擇性、能透過細(xì)胞膜的sirtuin抑制劑時(shí),能透過細(xì)胞膜的環(huán)肽類sirtuin底物將可以用于評估細(xì)胞內(nèi)各個(gè)sirtuin亞型的催化去�；钚�。通過SIRT1/2/3底物活性動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定,以kcat/Km為準(zhǔn),我們發(fā)現(xiàn)化合物1-3,5具有很好的SIRT1底物活性,其中化合物1,3,5的底物活性都超過了目前文獻(xiàn)報(bào)道的SIRT1最好的底物(kcat/Km=800M~(-1)s~(-1),且是個(gè)直鏈六肽)�；衔�1-3,5的SIRT3底物活性也都超過了目前文獻(xiàn)報(bào)道的SIRT3最好的底物(kcat/Km=990M~(-1)s~(-1),且是個(gè)直鏈六肽)。雖然化合物1-3,5的SIRT2底物活性(kcat/Km值)比目前文獻(xiàn)報(bào)道的SIRT2最好的底物(kcat/Km=176×10~3M~(-1)s~(-1))低了約12.5-63倍,但是這個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的底物是個(gè)直鏈九肽。由于在所有化合物(即1-3和5)中化合物5的結(jié)構(gòu)最為精簡,并且它的SIRT2底物活性和化合物3的SIRT3底物活性是所有化合物的SIRT1/2/3底物活性中最高的,所以化合物5被選出進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以考察它是否能透過細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生去�；磻�(yīng)。初步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明環(huán)肽化合物5可能不能通過細(xì)胞膜;這說明,雖然環(huán)肽比直鏈肽普遍有著強(qiáng)得多的細(xì)胞膜通透能力,但是這并不是說所有的環(huán)肽都能通過細(xì)胞膜。作為本部分工作的后續(xù),考量其它化合物的努力正在進(jìn)行中。(2)發(fā)展人類sirtuin抑制策略:Sirtuin催化的NAD~+依賴性的蛋白�；嚢彼崛ヵ；磻�(yīng)的抑制劑的發(fā)展對于更全面地研究sirtuin生物學(xué)和藥理學(xué)以及作為代謝和年齡相關(guān)疾病和癌癥的潛在治療劑具有重要價(jià)值。本課題組之前發(fā)現(xiàn)L-2-氨基-7-甲酰胺庚酸(L-ACAH)是個(gè)強(qiáng)效催化機(jī)制導(dǎo)向的sirtuin抑制彈頭,這個(gè)發(fā)現(xiàn)與其a-碳和側(cè)鏈酰胺氧之間的距離接近�；嚢彼嶂邢鄳�(yīng)的距離有關(guān),即L-ACAH的側(cè)鏈也能像�；嚢彼醾�(cè)鏈那樣與sirtuin催化活性中心結(jié)合。為了微調(diào)L-ACAH的側(cè)鏈?zhǔn)沟胊-碳和側(cè)鏈酰胺氧之間的距離更接近�；嚢彼嶂邢鄳�(yīng)的距離,我們設(shè)計(jì)并考察了含烯烴側(cè)鏈的L-ACAH類似物作為催化機(jī)制導(dǎo)向的sirtuin抑制彈頭的可能性以及功效。我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)類似物似乎也是一個(gè)催化機(jī)制導(dǎo)向的sirtuin抑制彈頭,但是它的抑制功效比L-ACAH弱(就SIRT1來說,弱了約7倍)。在本部分的論文工作中,我們還未能發(fā)展出比L-ACAH具有更強(qiáng)的催化機(jī)制導(dǎo)向的sirtuin抑制功效的L-ACAH類似物,但是后續(xù)工作仍在進(jìn)行中。(3)發(fā)展新型瘧原蟲sirtuin PfSir2A的抑制劑:人類寄生蟲sirtuins已被發(fā)現(xiàn)在各種條件下對寄生蟲有促進(jìn)存活的作用,所以這些sirtuins的幾個(gè)抑制劑已被報(bào)道。對于惡性瘧原蟲中的PfSir2A來說,目前只有兩個(gè)抑制劑已被報(bào)道,即煙酰胺(nicotinamide)和surfactin(文獻(xiàn)報(bào)道的IC_(50)值分別為51.2mM和35.2mM),而且對于更強(qiáng)的抑制劑surfactin來說,相對于人類sirtuin的PfSir2A的抑制選擇性也未知。在本部分的論文工作中,我們測試了本課題組已發(fā)展的9個(gè)人類sirtuin抑制劑(雙齒類及催化機(jī)制導(dǎo)向的抑制劑)對于PfSir2A的抑制強(qiáng)度�；衔�12被發(fā)現(xiàn)具有較好的對于PfSir2A的抑制強(qiáng)度及抑制選擇性(相對于人類SIRT1)。PfSir2A抑制劑12的發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步發(fā)展強(qiáng)效且具有選擇性的PfSir2A抑制劑奠定了一個(gè)初步但是好的基礎(chǔ)。與文獻(xiàn)中的PfSir2A抑制劑surfactin相比,化合物12的抑制效果強(qiáng)了約4倍,并且化合物12的結(jié)構(gòu)更精簡;其分子的模塊結(jié)構(gòu)對于更進(jìn)一步的構(gòu)效關(guān)系研究也有利。本部分的論文工作也表明,有效利用人類sirtuin和寄生蟲sirtuin的催化活性中心之間存在的結(jié)構(gòu)差異將成為今后發(fā)展強(qiáng)效且安全的抗寄生蟲病(特別是能對抗當(dāng)前的耐藥蟲)的一個(gè)主方向。
【圖文】：

賴氨酸殘基的去酰化具有非常重要的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的意義[1-10]。第一個(gè)被鑒定出的被如此調(diào)控的蛋白是存在于真核細(xì)胞中的組蛋白，并且現(xiàn)在已經(jīng)知道賴氨酸側(cè)鏈乙�；�/去乙�；材軌蛘{(diào)節(jié)原核和真核細(xì)胞中許多除組蛋白之外的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。從功能的角度來看，，通過賴氨酸側(cè)鏈乙�；�/去乙�；瘉碚{(diào)節(jié)蛋白已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證明在細(xì)胞及生命體中的多種生物過程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，如基因轉(zhuǎn)錄[11-14]，細(xì)胞周期進(jìn)程[15-19]，細(xì)胞凋亡[20-23]，DNA 修復(fù)和代謝[24-26]。從機(jī)制的角度來看，這些功能可以是來自動(dòng)態(tài)乙�；腿ヒ阴；^程對所修飾的蛋白本身的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)，也可以是乙酰賴氨酸介導(dǎo)的與含溴結(jié)構(gòu)域蛋白的特異性結(jié)合的結(jié)果。溴結(jié)構(gòu)域代表與乙酰賴氨酸結(jié)合的蛋白模塊家族，其含有約 110 個(gè)氨基酸殘基并存在于許多染色質(zhì)蛋白中，包括轉(zhuǎn)錄共激活因子，溴結(jié)構(gòu)域和核蛋白的額外結(jié)構(gòu)域（BET）家族，以及 ATP 依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物[27,28]。圖 1.1 為這三組分過程的示意圖。

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文而SIRT6能從�；嚢彼嵊行У厝コL鏈脂肪酰基，如肉豆蔻�；鵞43]。賴氨酸Nε-�；忻复俸头敲复賰煞N方式，典型的賴氨酸 Nε-乙�；峭ㄟ^酶促反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的，由蛋白賴氨酸 Nε-乙酰轉(zhuǎn)移酶（KAT）催化；而在線粒體基質(zhì)內(nèi)相對較高的pH 和�；w�；o酶 A 的濃度（mM 范圍），線粒體基質(zhì)中的乙�；顽牾；部梢酝ㄟ^非酶促實(shí)現(xiàn)。最近也有研究表明，乙酰磷酸也可以作為細(xì)菌中的乙酰供體用于非酶促蛋白賴氨酸 Nε-乙�；痆42,43]。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R91

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周r

本文編號：2627213