【摘要】：DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是一類負(fù)責(zé)解決DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的酶,這些酶在細(xì)胞的一些基礎(chǔ)生命活動(dòng),如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)、染色質(zhì)的重新構(gòu)建、M期染色體的濃縮和分離等中起著關(guān)鍵作用。隨著Topo Ⅱ毒劑被廣泛應(yīng)用于治療腫瘤疾病中,人們逐漸發(fā)現(xiàn)這些毒劑具有嚴(yán)重的副作用,如治療過程產(chǎn)生的耐藥、繼發(fā)性腫瘤和心臟毒性等,限制了其臨床使用。還會(huì)導(dǎo)致多藥耐藥性的產(chǎn)生,降低腫瘤細(xì)胞對化學(xué)藥物的敏感性,從而限制抗腫瘤藥物應(yīng)用。而常見的Topo Ⅱ毒劑,往往都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的DNA損傷作用,例如依托泊苷(Etoposide),或者容易被藥物外排泵排出細(xì)胞外,而降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度,導(dǎo)致藥物敏感性降低。同時(shí),TopoⅡ毒劑還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ水平的降低,導(dǎo)致細(xì)胞對TopoⅡ靶點(diǎn)的藥物敏感度降低。許多天然來源的吖啶酮類似物具有良好的抗腫瘤、抗菌、抗寄生蟲、抗炎等生理活性。同時(shí)吖啶酮類似物具有抑制P-gp以及MRP家族蛋白的功能。基于此,本研究對吖啶酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,希望發(fā)現(xiàn)活性好、毒副作用低,有潛在開發(fā)前景的新型Topo Ⅱ抑制劑。我們首先對2,6二氯苯甲酸的5位上硝基,第二步的進(jìn)行最為困難,經(jīng)過一系列的探究,最終利用了 Buchwald-Hartwig人名反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了中間體C的大量合成;第三步為傅克�；磻�(yīng),生成中間體D;第四步為不同氨基化合物的親核取代反應(yīng),生成E系列化合物;第五步為部分E系列化合物硝基還原成氨基,得到F系列化合物。接著我們對所得化合物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞增殖活性測試,選取三株腫瘤細(xì)胞(HCT116、SW480、HeLa),得到化合物對三株腫瘤細(xì)胞的IC50值,其中活性較好的化合物(IC5010 μM)有E24、E25、E27、E29、E30、E31、E32、E33、F8等幾個(gè)化合物。對這些化合物進(jìn)行體外Topo Ⅱα抑制活性分析,篩選出活性較好的Topo Ⅱα抑制劑:E24、E25、E29-E33等。綜合IC50值與體外酶活抑制情況我們選擇了 E33對其進(jìn)行機(jī)理研究。并得到了一些有意義的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。E33在體外能夠抑制Topo Ⅱα介導(dǎo)的超螺旋DNA解螺旋實(shí)驗(yàn)以及KDNA斷裂實(shí)驗(yàn),說明E33能夠抑制Topo Ⅱα的活性。同時(shí),E33顯著降低了腫瘤細(xì)胞的生存率,且表現(xiàn)出比依托泊苷更強(qiáng)的細(xì)胞毒性;E33顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的克隆形成;同時(shí)E33還顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的傷口愈合速率。我們發(fā)現(xiàn)E33并不引起顯著的細(xì)胞凋亡和周期阻滯作用,我們使用雙阻法檢測細(xì)胞對Gi/S期的影響,發(fā)現(xiàn)E33沒有引起Gi/S期的損傷;接著使用同樣的方法驗(yàn)證E33對G2/M期的影響,發(fā)現(xiàn)E33能夠使結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯;接著為了探究周期阻滯的原因,同時(shí)考慮到拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ在細(xì)胞周期中的作用,我們進(jìn)行了染色體伸展實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)E33能夠抑制腫瘤細(xì)胞染色體濃縮,因而我們得出結(jié)論染色體濃縮的抑制導(dǎo)致了HCT116細(xì)胞G2/M期阻滯。同時(shí)為了驗(yàn)證E33是否是通過抑制細(xì)胞內(nèi)Topo Ⅱ來發(fā)揮細(xì)胞功效,我們進(jìn)行了Topo Ⅱ-DNA捕獲實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)E33能夠抑制細(xì)胞內(nèi)Topo Ⅱ,但卻不引起Topo Ⅱ蛋白的降解;我們還發(fā)現(xiàn)E33不引起HCT116細(xì)胞DNA損傷,這一結(jié)果同時(shí)也解釋了為什么E33沒有引起Topo Ⅱ的降解。這些結(jié)果均表明了E33具有潛在的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性,同時(shí)表現(xiàn)出比傳統(tǒng)的Topo Ⅱ毒劑更好的性質(zhì),需要后續(xù)進(jìn)行深入的研究評價(jià)。
【圖文】：

細(xì)菌Ｔｏｐｏ邋Ｉ、真核生物Ｔｏｐｏ邋３以及只存在于一些嗜熱菌和細(xì)菌中的逡逑不常見的反旋轉(zhuǎn)酶。Ｔｏｐｏ邋３的結(jié)構(gòu)類似于掛鎖形狀，其中，區(qū)域Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ形成逡逑掛鎖的底部，區(qū)域ＩＩ形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖１．１），負(fù)責(zé)單鏈ＤＮＡ缺口的打開與逡逑關(guān)閉Ｉ８，，＇在高等真核細(xì)胞中，Ｔｏｐｏ邋３有兩種構(gòu)型，即ａ和Ｐ邋（表１．１），兩者與逡逑６逡逑

從作用機(jī)理來講，ＩＡ型和ＩＢ型拓?fù)洚悩?gòu)酶作用并不相同。丨Ａ型拓?fù)涿杆忮义希模危疗渲幸粭l單鏈生成５’末端缺口，然后將另一條鏈穿過缺口，從而達(dá)到解超逡逑螺旋的目的（圖１．３）；而ＩＢ型拓?fù)涿杆猓模危疗渲幸粭l單鏈生成３？末端缺口，逡逑８逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R914;R96

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本文編號(hào)：2626554