發(fā)布時間：2020-04-13 17:48

【摘要】：癌癥嚴(yán)重影響人類的健康,是人類主要的死亡病因之一。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)的報告,預(yù)計到2030年全球癌癥患者病例將達到2220萬。目前治療癌癥的手段主要有手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療等,其中傳統(tǒng)的化學(xué)治療雖然取得一定的治療效果,但仍存在療效差、預(yù)后不良、毒副作用嚴(yán)重且易產(chǎn)生耐藥性等缺點。癌癥的突出特征是癌細胞的生長不受控制,進而破壞正常的組織及器官,使之功能紊亂、結(jié)構(gòu)受損,最終影響機體的正常運轉(zhuǎn)。近年來,藥學(xué)工作者針對癌癥發(fā)生發(fā)展中特異性表達的激酶、受體和細胞因子等研發(fā)新型靶向藥物,以提高藥物對癌細胞的選擇性、安全性和耐受性,降低毒性,保證臨床療效。Aurora激酶和血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)是兩類重要的癌癥靶標(biāo)分子。Aurora是一類絲/蘇氨酸激酶,在中心體復(fù)制、紡錘體形成和染色體分配等有絲分裂過程關(guān)系密切,并參與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路。VEGFR2作為重要的酪氨酸激酶受體,可誘導(dǎo)腫瘤血管生成,促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,參與調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號通路。目前,還沒有Aurora激酶抑制劑用于臨床治療。雖然VEGFR2抑制劑索拉非尼、吉非替尼等在臨床上有較好的應(yīng)用,但仍存在抗腫瘤譜較窄、易產(chǎn)生耐藥和毒副作用大等缺點。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),化合物C0129和C0198具有較好的Aurora激酶抑制活性和抗腫瘤活性。同時發(fā)現(xiàn),化合物C0129對VEGFR2也有顯著的抑制活性。因此,本論文將對這兩個化合物的體內(nèi)外抗腫瘤活性及作用機制進行較為系統(tǒng)的研究�；衔顲0129是一種穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記的嘧啶類化合物,抑制Aurora A和VEGFR2的IC_(50)分別為0.061 nM和1.469 nM。CCK-8法測得化合物C0129對結(jié)腸癌細胞HT-29、肝癌細胞HepG2、非小細胞肺癌細胞A549、宮頸癌細胞HeLa和前列腺癌細胞PC-3等都有較強的增殖抑制活性,IC_(50)值分別為2.9?0.5μM、3.2?0.7μM、4.5?0.6μM、0.9?0.3μM和2.8?0.5μM,其中對HeLa細胞的抑制作用最強,對正常腎小球系膜細胞HRMC抑制不明顯。此外,EdU實驗表明在HeLa細胞中C0129可明顯抑制細胞的DNA復(fù)制。在HeLa細胞中,一方面,通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)C0129使紡錘體的形成受阻,影響細胞有絲分裂進程;細胞流式術(shù)和蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn)C0129能夠調(diào)控周期蛋白cdc2和cyclinB1的活性,使HeLa細胞周期阻滯在G2/M期;C0129還能夠誘導(dǎo)細胞凋亡,使BAD、Bax、caspase-3以及caspase-9促凋亡蛋白上調(diào),Bcl-2抑凋亡蛋白下調(diào),調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路的傳導(dǎo)。另一方面,C0129通過調(diào)控TGF-β、MMP2、MMP9和nm23-H1的表達,抑制HeLa細胞的遷移;C0129還通過調(diào)控FAK、VE-cadherin、YB-1以及p38MAPK蛋白的表達,減弱了HeLa細胞的侵襲能力。這些作用與C0129調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號通路有關(guān)。藥代動力學(xué)研究表明C0129單次口服給藥后其半衰期為4.12 h,達峰時間為4 h,而急性毒性實驗顯示其LD_(50)大于1000 mg/kg;體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)C0129在50 mg/kg時,體內(nèi)對HeLa細胞移植瘤的抑瘤率為70%,高于VX680的50%;器官組織HE結(jié)果顯示C0129在體內(nèi)的毒性不明顯,和急性毒性實驗結(jié)果一致。綜合上述結(jié)果,證明化合物C0129是一種Aurora A激酶和VEGFR2激酶受體雙靶點抑制劑,體內(nèi)外均具有較好的抗腫瘤活性,且有較好的成藥性,具有進一步開發(fā)研究的價值。化合物C0198是一種酞嗪酮類Aurora激酶抑制劑,體外抑制Aurora A和Aurora B的IC_(50)分別為118 nM和80 nM;在細胞水平能明顯抑制結(jié)腸癌細胞HCT-116和LoVo、前列腺癌細胞PC-3、宮頸癌細胞HeLa和非小細胞肺癌細胞A549的活性,CCK-8法測得IC_(50)值分別為0.83?0.2μM和2.2?0.7μM、1.75?0.6μM、3.2?0.5μM以及2.8?0.5μM;C0198對Aurora激酶高表達的HCT-116和PC-3腫瘤細胞的抗增殖活性最顯著,而在正常腎小球系膜細胞HRMC中的毒性較小。在HCT-116細胞和PC-3細胞中,C0198通過阻滯細胞有絲分裂停滯在G2/M期,最終抑制了腫瘤細胞的增殖。C0198對腫瘤細胞周期的調(diào)控與它抑制Aurora A和Aurora B的活性直接相關(guān)。一方面,C0198通過抑制Aurora A在Thr288位的磷酸化,使Aurora A對CDC25B在Ser353位的磷酸化激活減弱,降低了CDC25B對cdc2/CyclinB1的調(diào)控作用;C0198通過抑制Aurora A的活性,使中心體的功能異常,導(dǎo)致紡錘體形成受阻,而微管蛋白是紡錘體的基本構(gòu)成。另一方面,C0198通過抑制Aurora B在Thr232位的磷酸化,影響著絲粒的功能,引起染色體缺失和損壞,使染色體正常復(fù)制和分配紊亂,從而使紡錘絲連接并牽拉姐妹染色體的分離異常,最終染色體不能有序分配到子細胞中去,使細胞有絲分裂停滯在G2/M期。因此,C0198阻滯腫瘤細胞周期在G2/M期誘導(dǎo)細胞的死亡是抑制Aurora A和Aurora B激酶活性的結(jié)果。此外,體內(nèi)急性毒性實驗和藥代動力學(xué)實驗表明,C0198的LD_(50)大于1000 mg/kg,半衰期為21 h,達峰時間為1.6 h,說明機體對C0198的吸收較快。裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)C0198抑瘤作用顯著,在HCT-116細胞移植瘤模型中,90 mg/kg C0198的抑制率為75%,高于VX680的60%;在PC-3細胞移植瘤模型中,90 mg/kg C0198的抑制率為66%,高于VX680的55%。組織器官HE結(jié)果顯示,C0198對機體的器官損傷不明顯,該結(jié)果和急性毒性結(jié)果一致。綜上所述,C0198作為Aurora激酶泛抑制劑,在細胞水平和體內(nèi)移植瘤水平均有顯著的抗腫瘤活性,并且毒性較低,成藥性較強,有進一步研究開發(fā)的價值�？傊�,本論文對本課題組發(fā)現(xiàn)的兩種激酶抑制劑的抗腫瘤活性及其作用機制進行了較為詳細的研究,為進一步研究開發(fā)奠定了較好的基礎(chǔ)。
【圖文】：

究者致力于研究靶向蛋白激酶的抑制劑，從而阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，達到目的。 Aurora 蛋白激酶1 Aurora 蛋白激酶結(jié)構(gòu)Aurora激酶是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，于1988年在對果蠅參與有絲體功能研究中被發(fā)現(xiàn)[13]，同時發(fā)現(xiàn)Aurora激酶在人類腫瘤組織中也有表Aurora激酶結(jié)構(gòu)包括309~403個氨基酸的序列。根據(jù)氨基酸序列的不ora激酶分為Aurora A、Aurora B 和 Aurora C 三種亞型，這三個亞型的度相似，均含有一個N-端調(diào)控區(qū)和一個C-端催化區(qū)以及一個蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域包含有活性催化T環(huán)和降解盒，且ATP腺嘌呤環(huán)結(jié)合位點的殘基也（圖1-1）。但三種亞型在細胞分裂中卻呈現(xiàn)出完全不同且互不重疊的功能

最多。在中心體上，Aurora A 被 LIM 蛋白家族的 ajuba 蛋心體的復(fù)制和分離，使細胞進入有絲分裂期�；罨� Aurora粒蛋白，包括 tubulin，TACC 等到微管形成中心（MTOCs），[17]。因此，AuroraA 激酶與 G2/M 期阻滯和轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，它胞周期 G2/M 期阻滯和誘導(dǎo)細胞凋亡，并激活 G2/M 期檢查]。因此，Aurora A 的異常表達可擾亂正常的有絲分裂，同時能3 是重要的抑癌基因。此外，在細胞有絲分裂進程中，核膜在roraA 被激活，然后通過 TPX2 靶向作用于微管，進行紡錘體的錘體微管構(gòu)象形成，，TPX2 作為微管相關(guān)蛋白，在細胞周期的用，它能夠保護 Aurora A 蛋白激酶不被水解，同時，Aurora2 的活性，共同維護紡錘體的組裝和細胞周期進行[19]。在此過以與 Borealis(Bora)結(jié)合，對紡錘體的組裝及穩(wěn)定起調(diào)節(jié)作用響 Bora 的活性，調(diào)控有絲分裂進程[20]。AuroraA 可以通過激
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2626256