【摘要】：流感病毒是人類呼吸道最為常見的一種病毒,季節(jié)性流感的不斷爆發(fā)嚴(yán)重威脅著人類健康。由于流感病毒內(nèi)在不斷演變的特點(diǎn),使流感疫苗的療效受限;隨著抗流感藥物在臨床上廣泛使用,耐藥病毒株的不斷出現(xiàn)限制了現(xiàn)有抗病毒藥物的療效。因此,尋找新的抗流感病毒的治療方案是研究人員需要攻克的難題。天然免疫反應(yīng)在感染性疾病進(jìn)程中發(fā)揮的重要作用近幾年引起了人們的廣泛關(guān)注,一系列參與天然免疫反應(yīng)調(diào)控的宿主因子被逐漸發(fā)現(xiàn),以其不易突變性,抗病毒活性廣譜等優(yōu)勢,成為篩選抗病毒藥物靶點(diǎn),尋找新的抗病毒方案的重要來源。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Miz1(Myc-interacting zinc finger protein 1;Zbtb17)是一種最初通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的癌基因Myc的結(jié)合伴侶,參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞周期及凋亡等多種生命活動過程,其活性主要與位于蛋白N端的POZ(Pox virus and Zinc finger)結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,Miz1也參與調(diào)控機(jī)體的天然免疫反應(yīng),Miz-1通過其POZ結(jié)構(gòu)域,與轉(zhuǎn)錄因子Rel-A競爭結(jié)合于CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ(CCAAT/enhancer binding protein σ,CEBP-σ)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域,抑制LPS和細(xì)菌引起小鼠肺部產(chǎn)生過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。流感病毒是造成呼吸系統(tǒng)疾病的重要致病因子,在流感病毒入侵機(jī)體時,Miz1是否發(fā)揮調(diào)控作用?其具體的機(jī)制是怎樣的?目前尚無報道。本課題圍繞Miz1在流感病毒感染中發(fā)揮的調(diào)控作用進(jìn)行了深入研究。我們發(fā)現(xiàn),特異性敲除小鼠肺上皮中Miz1蛋白POZ結(jié)構(gòu)可顯著增強(qiáng)小鼠對流感病毒的抵抗力,與對照組Miz1(POZ)fl/fl小鼠相比,病毒感染后Miz1 APoZ-Hung基因敲除小鼠生存率明顯提高,病毒感染伴隨的體重下降有所減輕,肺部病毒載量低于對照組小鼠,提示我們Miz1或作為負(fù)性調(diào)控因子,參與調(diào)控機(jī)體的抗病毒反應(yīng)。在流感病毒感染4天后,我們抽取小鼠肺灌洗液用ELISA檢測小鼠肺部炎癥細(xì)胞因子的分泌,其中Miz1ΔPoZ-lung小鼠肺灌洗液中Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)含量明顯高于對照組Miz1(POZ)fl/fl小鼠,而其他炎癥因子如IL-6,MCP1,IL-1β等在兩組小鼠間水平相當(dāng)。Ⅰ型干擾素是機(jī)體重要的抗病毒細(xì)胞因子,我們推測,Miz1對流感感染小鼠的調(diào)控作用主要依賴于Miz1調(diào)控病毒感染后小鼠體內(nèi)Ⅰ型干擾素的表達(dá)相關(guān)。與體內(nèi)結(jié)果一致,在小鼠肺上皮細(xì)胞MLE12敲除Miz1基因可以增強(qiáng)流感病毒感染后IFN-α和IFN-β的表達(dá),同時抑制細(xì)胞中流感病毒的復(fù)制,而Miz1蛋白的對宿主抗病毒反應(yīng)的調(diào)控作用與其轉(zhuǎn)錄功能密切相關(guān)。在此研究中,我們還發(fā)現(xiàn)病毒感染可以引起Miz1蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的積累,主要與病毒感染介導(dǎo)的Miz1蛋白E3泛素連接酶Mule的降解有關(guān);病毒通過降解Mule導(dǎo)致Miz1的表達(dá)升高,進(jìn)而降低IFN-β的表達(dá),幫助病毒逃逸宿主的天然免疫監(jiān)視。我們還發(fā)現(xiàn),流感病毒通過劫持宿主細(xì)胞中Cullin-RNIG E3泛素連接酶家族成員CUL4B的作用,促進(jìn)Mule的降解。我們進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)及l(fā)uciferase熒光報告基因等結(jié)果證明:Miz1通過與干擾素調(diào)控因子(Interferon Regulatory Factors)IRF3/IRF7競爭,結(jié)合于IFN-β轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)域,抑制流感病毒感染后IFN-β的轉(zhuǎn)錄。核小體染色質(zhì)中組蛋白的翻譯后修飾(如乙酰化,甲基化等)與基因表達(dá)密切相關(guān),我們發(fā)現(xiàn)流感病毒感染后Miz1還可以招募組蛋白去乙�；�1(Histone deacetylase 1,HDAC1)至IFN-β轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)域,降低IFN-β核小體中組蛋白H3的乙�；�,從而抑制IFN-β的表達(dá)。綜上,我們的研究首次發(fā)現(xiàn)Miz1蛋白在流感病毒的感染過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,并在基因水平提供了 Miz1參與調(diào)控IFN-β轉(zhuǎn)錄的直接證據(jù);同時,我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了病毒感染后Miz1及其相關(guān)蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控機(jī)制,為病毒如何利用宿主抗病毒機(jī)制幫助自身復(fù)制提出了新的見解。這一系列的研究加深了我們宿主抗病毒反應(yīng)機(jī)制和流感病毒的致病機(jī)制的了解,為尋找新的抗流感病毒方案提供新的思路。
【圖文】：

ＮＳ）編碼參與免疫逃避的非結(jié)構(gòu)蛋白ｌ（Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋１，邋ＮＳ１）和出核蛋白（Ｎｕｃｌｅａｒ逡逑Ｅｘｐｏｒｔ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＮＥＰ），又稱ＮＳ２，介導(dǎo)病毒核蛋白復(fù)合物的出核。逡逑如圖１所示，流感病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)后，在胞內(nèi)體的酸性環(huán)境下由ＨＡ誘導(dǎo)病逡逑毒包膜與胞內(nèi)體膜融合，從而將病毒核酸物質(zhì)釋放入胞漿，進(jìn)一步被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞逡逑核，在細(xì)胞核內(nèi)開始病毒核酸物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制：流感病毒的ＲＮＡ聚合酶首先逡逑利用病毒ＲＮＡ為模板進(jìn)行ｍＲＮＡ的合成，ｍＲＮＡ被運(yùn)往胞漿內(nèi)進(jìn)行病毒蛋白表達(dá)：逡逑同時病毒基因組ＲＮＡ通過正鏈中間體ｃＲＮＡ進(jìn)行新的病毒ＲＮＡ的合成。新合成的逡逑病毒ＲＮＡ聚合酶亞基進(jìn)入胞核內(nèi)完成病毒核酸－蛋白復(fù)合物ＲＮＰ的裝配，然后從逡逑胞核輸出到胞漿中與其他流感病毒蛋白一起組裝成為新的病毒顆粒，成熟的顆逡逑粒通過細(xì)胞膜完成出芽和釋放。逡逑２逡逑

對于伊拉米韋的耐藥株目前尚未報道［１６］。逡逑現(xiàn)有抗流感藥物的局限性及病毒耐藥株的出現(xiàn)，推動了新型抗流感病毒逡逑藥物的開發(fā)與研究。如圖２所示，目前在研的抗流感藥物主要可分為兩類：逡逑一類為以病毒相關(guān)基因或蛋白為靶點(diǎn)的藥物；另一類為以宿主因子為靶點(diǎn)的逡逑藥物，這類藥物相較于以病毒為靶點(diǎn)的藥物，不易產(chǎn)生耐藥，且具有廣譜的逡逑抗病毒活性。目前，有多種新型抗流感藥物進(jìn)入臨床研究，，如：Ｆｌｕｄａｓｅ？逡逑（ＤＡＳ１８１），Ｆａｖｉｐｉｒａｖｉｒ（Ｔ－７０５），和硝唑尼特（Ｎｉｔａｚｏｘａｎｉｄｅ）。Ｆｌｕｄａｓｅ邋由細(xì)菌來逡逑源的唾液酸酶與呼吸道上皮生長因子連接組成，可以有效地靶向呼吸道上皮逡逑４逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2626131