【摘要】：背景:頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率極高。這些腫瘤大多處于表淺或重要的解剖位置,而傳統(tǒng)的治療方式存在各自的局限性,所以目前亟需一種有效、微創(chuàng)、全身低毒的治療方式。水凝膠以其優(yōu)越的性能如微創(chuàng)、靶向、控釋、易降解等受到了廣泛關(guān)注。然而,將化療藥物和光敏劑共裝載至水凝膠中的報道卻很少。在本研究中,我們合成了一種納米阿霉素-吲哚菁綠基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性水凝膠(簡稱NDIMH),將化療和光療結(jié)合,以期為HNSCC提供一種新的治療策略。第一部分:納米阿霉素-吲哚菁綠基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)水凝膠的合成及表征首先合成基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)水凝膠(簡稱MH),應(yīng)用掃描電鏡觀察其形態(tài)、MTT法檢測了細(xì)胞毒性及觀察體內(nèi)外降解情況;進(jìn)一步應(yīng)用溶劑-反溶劑法制備納米阿霉素及納米吲哚菁綠,并對納米藥物的穩(wěn)定性、粒徑分布、表面形態(tài)等進(jìn)行表征;最后將納米阿霉素及納米吲哚菁綠裝載至基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)水凝膠內(nèi),合成納米阿霉素-吲哚菁綠基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性水凝膠(簡稱納米雙載藥智能水凝膠),再次應(yīng)用掃描電鏡和體外藥物釋放試驗對其進(jìn)行表征,明確理化性質(zhì)。同時制備了納米阿霉素基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性水凝膠(簡稱NDMH)和納米吲哚菁綠基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性水凝膠(簡稱NIMH),以便后續(xù)研究。結(jié)果顯示,MH在掃描電鏡下疏松多孔,利于藥物的裝載,對細(xì)胞增殖無毒副作用,并具有良好的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)響應(yīng)特性;制備的納米藥物穩(wěn)定性良好,用透射電鏡觀察納米顆粒表面光滑圓整、分布均勻。納米阿霉素平均粒徑為81 nm左右,納米吲哚菁綠為109nm左右;納米雙載藥智能水凝膠納米藥物在智能水凝膠中均勻分布,體內(nèi)外藥物釋放實(shí)驗顯示,納米雙載藥智能水凝膠在MMPs條件下能緩慢釋放納米藥物,具有良好的MMPs響應(yīng)特性。第二部分:納米阿霉素-吲哚菁綠基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)水凝膠的光敏特性研究通過體內(nèi)外光熱實(shí)驗、細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測和體外細(xì)胞攝取實(shí)驗評估納米雙載藥智能水凝膠潛在的光療特性。首先,利用紅外熱像儀監(jiān)測激光照射下磷酸鹽緩沖液、游離吲哚菁綠溶液、游離納米吲哚菁綠溶液、納米吲哚菁綠智能水凝膠和納米雙載藥智能水凝膠體內(nèi)外的溫度變化,以評價其體外光熱特性;然后檢測了納米吲哚菁綠智能水凝膠、納米吲哚菁綠智能水凝膠+激光、納米雙載藥智能水凝膠+激光各組活性氧的產(chǎn)生情況;最后通過細(xì)胞攝取實(shí)驗檢測了納米阿霉素智能水凝膠組和納米雙載藥智能水凝膠+激光組(808 nm,0.5 W/cm2,8 minutes)阿霉素的攝取情況。體內(nèi)外光熱實(shí)驗結(jié)果顯示,在激光(808nm,1.0 W/cm2)照射下,納米吲哚菁綠智能水凝膠和納米雙載藥智能水凝膠升溫最高,體內(nèi)分別增加到了 63.2℃和65.6℃,體外為54.9℃和54.0℃,表明納米雙載藥智能水凝膠具有良好的光熱效能;活性氧實(shí)驗結(jié)果顯示,納米吲哚菁綠智能水凝膠在808nm激光照射(0.5 W/cm2,8 minutes)后有較強(qiáng)的熒光,而納米吲哚菁綠智能水凝膠組的熒光強(qiáng)度很弱或不存在,說明近紅外照射是光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧的先決條件。納米吲哚菁綠智能水凝膠+激光組和納米雙載藥智能水凝膠+激光組,熒光強(qiáng)度無差異,說明阿霉素并不能促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生;細(xì)胞攝取實(shí)驗結(jié)果顯示,納米雙載藥智能水凝膠+激光組熒光信號要強(qiáng)于納米阿霉素智能水凝膠組,說明激光照射可以促進(jìn)細(xì)胞對阿霉素的吸收。第三部分:納米阿霉素-吲哚菁綠基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)水凝膠的體內(nèi)外藥效學(xué)研究以SCC-15為細(xì)胞模型,考察了納米雙載藥智能水凝膠+激光(808 nm,0.5 W/cm2,8 minutes)的對細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響及MMP-2敏感性。MTT實(shí)驗結(jié)果顯示,納米阿霉素智能水凝膠組、納米吲哚菁綠智能水凝膠+激光組及納米雙載藥智能水凝膠+激光組對SCC-15的增殖侵襲均有不同程度的抑制作用,但納米雙載藥智能水凝膠+激光組抑瘤效果最強(qiáng),尤其是在MMP-2存在的前體下;Transwel實(shí)驗及劃痕實(shí)驗結(jié)果提示,納米雙載藥智能水凝膠在光照條件下,可抑制SCC-15的侵襲和轉(zhuǎn)移。以SCC-15荷瘤裸鼠為動物模型,待瘤體長至150-200mm3時,瘤內(nèi)注射給藥,對比生理鹽水組、納米阿霉素智能水凝膠組、納米吲哚菁綠智能水凝膠+激光組、納米雙載藥智能水凝膠+激光組裸鼠相對瘤體體積變化、考察各制劑的體內(nèi)藥效學(xué)性質(zhì)。同時將各組腫瘤組織進(jìn)行免疫組化,檢測Ki67的表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況,進(jìn)一步評估各制劑的抗腫瘤效果。結(jié)果顯示,體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗顯示,與單一治療組納米阿霉素智能水凝膠、納米吲哚菁綠智能水凝膠+激光相比,聯(lián)合治療組納米雙載藥智能水凝膠+激光抑瘤效果最為明顯。免疫組化結(jié)果顯示,納米雙載藥智能水凝膠+激光組Ki67表達(dá)量最少,細(xì)胞凋亡數(shù)最多,進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合治療比單一治療抗腫瘤效果更強(qiáng)。綜上說明在808nm激光照射下,納米雙載藥智能水凝膠可以實(shí)現(xiàn)光化協(xié)同治療,優(yōu)化治療效果。第四部分:納米阿霉素-吲哚菁綠基質(zhì)金屬蛋蛋白酶響應(yīng)水凝膠的體內(nèi)安全性評價及代謝分布研究以SCC-15荷瘤裸鼠為動物模型,給予藥物干預(yù),分組同上。在整個實(shí)驗期間,定期測量各組小鼠的體重變化。治療結(jié)束后收集裸鼠的主要器官腦、心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行HE染色。數(shù)據(jù)顯示,治療期間小鼠體重?zé)o明顯變化,主要器官HE染色結(jié)果未見異常。這些結(jié)果表明,所有的制劑均具有良好的生物安全性,局部控釋給藥可以實(shí)現(xiàn)靶向遞送,大大降低藥物的毒副作用。利用小動物活體熒光成像系統(tǒng)檢測瘤內(nèi)注射游離阿霉素+吲哚菁綠水溶液或納米雙載藥智能水凝膠后,在特定時間點(diǎn)阿霉素和吲哚菁綠的熒光信號。168小時處死小鼠,采集小鼠的腫瘤及主要臟器進(jìn)行體外熒光成像分析。結(jié)果顯示,剛開始時阿霉素和吲哚菁綠主要聚集在腫瘤部位,游離組和凝膠組的熒光信號面積在24小時內(nèi)逐漸變大。24小時后,游離組的熒光信號迅速下降,168小時幾乎消失。與之相反的是,納米雙載藥智能水凝膠組的熒光信號強(qiáng)度并沒有明顯下降,注射168小時后腫瘤部位依然可以檢測到熒光信號;體外熒光成像結(jié)果顯示,凝膠組的阿霉素和吲哚菁綠均分布在腫瘤部位和重要臟器中,其熒光信號強(qiáng)度遠(yuǎn)高于游離組。以上結(jié)果表明納米雙載藥智能水凝膠具有良好的藥物緩釋性能,大大延長了阿霉素和吲哚菁綠在瘤內(nèi)的滯留時間。在本研究中,我們結(jié)合靶向技術(shù)、納米技術(shù)、光化聯(lián)合治療及熒光成像技術(shù),成功地設(shè)計了一種新型的藥物傳遞系統(tǒng),即NDIMH,能夠在腫瘤微環(huán)境中持續(xù)釋放納米阿霉素和納米吲哚菁綠。通過物理化學(xué)表征、光敏實(shí)驗及體內(nèi)外藥效學(xué)研究證實(shí)了抗腫瘤效果。據(jù)我們所知,這是首次將納米阿霉素和納米吲哚菁綠加載到對MMPs敏感的水凝膠中,用于治療鱗癌(專利申請?zhí)?201810815535.2)。綜上所述,我們開發(fā)了一種新型的藥物傳遞系統(tǒng),并證明瘤內(nèi)注射納米雙載藥智能水凝膠加以808nm近紅外照射,或可作為治療HNSCC的一種新策略。
【圖文】：

腫瘤微環(huán)境是由各種基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，具有低ｐＨ、低氧、高壓等逡逑特點(diǎn)，并含有大量酶、生長因子等，調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等Ｐ邋１４１逡逑（圖１）。傳統(tǒng)的抗腫瘤方式大多以直接殺死腫瘤細(xì)胞為主，近年來，越來越多的逡逑研究專注于靶向腫瘤微環(huán)境，利用腫瘤特殊的微環(huán)境而設(shè)計的ｐＨ響應(yīng)、酶響應(yīng)型逡逑等載藥系統(tǒng)層出不窮［｜４］�；|(zhì)金屬蛋白酶（ＭＭＰｓ）是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶，在逡逑許多實(shí)體瘤內(nèi)都高表達(dá)。ＭＭＰｓ可以降解天然細(xì)胞外基質(zhì)（ＥＣＭ）和基底膜，為逡逑腫瘤生長開辟更多的空間［１５＿｜７］。目前，以ＭＭＰｓ為靶點(diǎn)設(shè)計的新型載藥系統(tǒng)日益逡逑增多，并取得了一定進(jìn)展［１８］。逡逑樹突狀細(xì)胞逡逑／邐＾a萇懾義希懼鍄U逡逑ｗｍｒｎｍ邋／邐＼邐＾邐灥逡逑梊、＃��？a懾義獻(xiàn)勻簧鄙訟赴臥洞ψ棋義賢跡敝琢鑫⒒肪持邢赴淶南嗷プ饔茫郟矗蒎義瞎飭埔云湮⒋礎(chǔ)邢蛐院謾⒉渙擠從π�、可重复治令l扔攀�，灾I肪輩繙W癌逡逑治療中展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景［｜９＿２１］。腫瘤光療包括光熱治療（ＰＴＴ）和光動力治療逡逑（ＰＤＴ）。光熱治療指的是在激光照射下，通過激光產(chǎn)生的高熱量來破壞消除腫瘤逡逑細(xì)胞。常用的激光有紫外光（ＵＶ）、可見光和近紅外光。與紫外線／可見光相比

特定波長的光、光敏劑、活性氧是光動力治療的三大基本要素。光動力治逡逑療抗腫瘤機(jī)制（１）直接殺傷腫瘤細(xì)胞（２）損傷腫瘤血管（３）促進(jìn)局部炎癥（４）逡逑引發(fā)腫瘤免疫反應(yīng)［２３］。在光照條件下，光熱治療通常與光動力療法同時存在，光逡逑熱治療將光能轉(zhuǎn)換成熱能殺死腫瘤細(xì)胞；而光動力療法中，光能將光敏劑激發(fā)產(chǎn)逡逑生活性氧（ＲＯＳ），從而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡［２４］。逡逑對于晚期腫瘤，單一手段往往不能完全殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到良好的治療效果。逡逑而光化聯(lián)合治療可以相輔相成，為惡性腫瘤提供新的治療策略［５，，２５］。光療可以輔助逡逑化療，增強(qiáng)靶向特異性，并通過改變血管通透性介導(dǎo)藥物更好的在腫瘤區(qū)富集（圖逡逑２）；化療可以輔助光療，清除殘余腫瘤細(xì)胞并抑制損傷血管的再生，有效抑制腫逡逑瘤復(fù)發(fā)（圖３）。光化聯(lián)合治療可以增強(qiáng)抗腫瘤療效并減少全身的毒副反應(yīng)。此外，逡逑抗癌藥物木身可能存在氧化應(yīng)激，產(chǎn)生羥基自由基，當(dāng)與光動力療法結(jié)合時，這逡逑些自由基能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性死亡［２６］。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.91;R943

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