【摘要】：多肽作為一類優(yōu)良的基因/藥物載體,具有生物活性多樣、免疫原性低、生物相容性好以及可控的自組裝性能等多種優(yōu)點,被廣泛地應(yīng)用于基因/藥物的傳輸體系中,同時,一些從生物中提取出的特殊結(jié)構(gòu)的多肽片段也可以作為治療性分子,也逐漸應(yīng)用于抗癌、抗菌等領(lǐng)域。將多肽作為基因或藥物載體、或?qū)⑵湫揎椩谄渌d體上,裝載藥物或基因形成納米組裝體,可以促進藥物或基因的細胞內(nèi)化,控制藥物在腫瘤組織中的定點釋放,提高基因轉(zhuǎn)染效率,增強藥物的治療效果。近年來,利用多肽修飾介導(dǎo)的藥物和基因的傳遞研究以及其在抗癌、抗菌等領(lǐng)域的研究備受專家學(xué)者關(guān)注。本論文從多肽的不同優(yōu)勢出發(fā),研究了新型多肽在抗癌藥物傳輸方面以及其作為治療性分子在抗癌、抗菌領(lǐng)域的潛能。第一部分是多肽的制備、純化和檢測。采用標準Fmoc固相多肽合成(SPPS)技術(shù),在2-氯-三苯甲基氯樹脂固相反應(yīng)器中,合成了實驗中需要的七條多肽鏈:抗菌肽FIGAIARLLSKIF(Kn2)、FIKRIARLLRKIF(Kn2-7)、CKn2、CKn2-7、CKn2-RGDS(AP1)、CKn2-7-RGDS(AP2)、全保護多肽Nap-FFY(t-Bu)E(OtBu)-OH,并利用Bruker 400 MHz核磁共振和LCQ Advantage型電噴霧質(zhì)譜儀對合成的各種多肽鏈進行表征。通過雙電荷峰計算,實際的NLS分子量與計算出的理論值一致。并用高效液相色譜(HPLC)檢測每條多肽鏈的純度。第二部分在抗菌肽BmKn2及其突變體BmKn2-7的基礎(chǔ)上,在多肽的N端添加一個半胱氨酸,并利用Au-S配位鍵,構(gòu)建多肽修飾的納米金顆粒(AuNP@Kn2和AuNP@Kn2-7)�；趯嶒炘O(shè)計,我們完成了Kn2、Kn2-7、CKn2、CKn2-7、CKn2-RGDS(AP1)、CKn2-7-RGDS(AP2)的設(shè)計和合成。我們利用檸檬酸鈉法在可控狀態(tài)下將氯金酸還原成粒徑在約為18 nm的納米金顆粒。并將源于蝎毒液的毒素多肽BmKn2-7修飾納米金,并進一步研究其毒性,我們成功制備了多肽Kn2-7修飾的納米金載體(AuNP@Kn2-7),粒徑為34nm,相比較于多肽載體Kn2-7而言,具有較低的細胞毒性;另外,我們成功制備了Kn2-7-RGDS修飾的納米金載體(AuNP@Kn2-7-RGDS),粒徑為96 nm。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),Kn2-7-RGDS修飾的納米金載體(AuNP@Kn2-7-RGDS)具有一定的腫瘤細胞抑制效果。第三部分制備含有多肽Nap-FFYE-CO-NH-(CH_2)_2-SS-MP抗腫瘤6-MP前體藥物。由于該多肽片段Nap-FFYE-OH具有優(yōu)良的自組裝性能,通過透射電子顯微鏡(TEM)觀測到,該6-MP前體藥物Nap-FFYE-CO-NH-(CH_2)_2-SS-MP可以在中性水溶液中發(fā)生自組裝,進而形成直徑為50 nm左右的納米纖維。體外藥物釋放實驗結(jié)果顯示,在不含谷胱甘肽(GSH)的條件下,6-MP前體藥物中的6-MP沒有顯示出任何釋放,但是在模擬腫瘤環(huán)境條件下,控制GSH濃度為40mM,二硫鍵發(fā)生斷裂,體外釋藥曲線顯示出明顯的GSH敏感性,24 h后的累計藥物釋放效率幾乎達到了75%。同時體外細胞毒性實驗結(jié)果也證明,6-MP前體藥物比游離的6-MP具有更低的細胞毒性。因此,這種含二硫鍵的還原敏感性6-MP前體藥物,有望能夠改善抗癌藥物6-巰基嘌呤穩(wěn)定性能差,細胞毒副作用大的缺陷,并且進一步實現(xiàn)腫瘤部位的響應(yīng)性藥物釋放,使得抗腫瘤藥物6-巰基嘌呤富集于腫瘤細胞,因而在癌癥的臨床治療上有一定的應(yīng)用潛能。
【圖文】：

圖 1-1 固相肽合成（SPPS）[17]Fig. 1-1 Solid-phase peptide synthesis (SPPS).3 功能性多肽由于腫瘤細胞生長失去控制、基因異常表達等特點，因而腫瘤組織與織表現(xiàn)出非常不同的生理特性[18, 19]（如圖 1-2）：①腫瘤細胞內(nèi)還原物質(zhì)遠遠高于正常細胞；②腫瘤細胞內(nèi)和腫瘤細胞外均呈現(xiàn)出弱酸性環(huán)境；④胞內(nèi)線粒體中的活性氧含量很高；④腫瘤細胞內(nèi)和腫瘤細胞外很多酶均過；⑤腫瘤細胞質(zhì)中含有大量的三磷酸腺苷等�？紤]到上述腫瘤的特點，我計出針對于腫瘤組織的功能性藥物載體，為了能夠解決藥物載體的靶向遞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)運、靶點定位釋藥、高滲透等難以解決的問題。在過去的二十年多的專家學(xué)者已經(jīng)進行了大量的努力來研發(fā)新型靶向藥物遞送系統(tǒng)，因為靶向藥物傳遞系統(tǒng)有望能夠解決與當(dāng)前臨床實踐相關(guān)的幾個關(guān)鍵治療問題

內(nèi)藥物釋放效率低下或者細胞內(nèi)運輸過程的效果較差。最終研究學(xué)者認識到許多治療劑（例如抗癌藥物、抗氧化劑、光敏劑等）和生物治療劑（例如多肽、蛋白質(zhì)藥物、siRNA、DNA 等）只有被遞送并釋放到細胞區(qū)室中（例如細胞質(zhì)或細胞、細胞核）才能夠以發(fā)揮治療作用[22, 23]。因此，潛在的靶向藥物遞送系統(tǒng)不僅應(yīng)該能夠克服細胞外屏障（例如長循環(huán)時間、與靶細胞的選擇性結(jié)合、在患病部位的優(yōu)先積累等），而且還應(yīng)該能夠同樣克服細胞內(nèi)屏障（例如細胞內(nèi)化、內(nèi)體逃逸、藥物釋放等）。在過去的幾年中，設(shè)計新型生物響應(yīng)納米載體，響應(yīng)細胞內(nèi)信號，特別是酸性 pH 和氧化還原電位，釋放藥物，受到了極大的關(guān)注。pH敏感型納米載體在低 pH 值情況下不穩(wěn)定，通常在低至 5.5 和 4.5 的 pH 值的條件下釋放藥物，比如在在內(nèi)體和/或溶酶體區(qū)室等低 pH 釋放藥物。相比之下，氧化還原響應(yīng)載體主要用于在細胞質(zhì)中分解和釋放藥物，其含有比細胞外液（約 2-20 μM）高 2 至 3 個數(shù)量級的谷胱甘肽（GSH）三肽（約 2-10 mM）（如圖 1-3）[24]。
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R96

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本文編號：2626052