【摘要】：與血管生成相關(guān)的疾病如實(shí)體腫瘤、眼部血管增生類疾病是研究工作中一類熱點(diǎn)疾病,抑制新生血管的生成是治療此類疾病的首要選擇。病理性新生血管的生成多與促血管生成因子和血管生成抑制因子的失衡有關(guān)。其中,促血管生成因子主要包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等,對(duì)新生血管的生成起著至關(guān)重要的的作用。Tat作為細(xì)胞穿膜肽已得到廣泛應(yīng)用,在Tat的幫助下蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)體等都能順利穿透細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞。RGD可以與整合素αvβ3特異性結(jié)合,通常作為靶向肽應(yīng)用于各類研究。碳端規(guī)則(C-end rule,CendR)是Ruoslahti團(tuán)隊(duì)利用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種位置效應(yīng)。在碳端具有R/KXXR/K結(jié)構(gòu)的肽鏈可以與靶細(xì)胞上的神經(jīng)纖毛蛋白1(NRP1)受體結(jié)合,其中X表示除精氨酸與賴氨酸之外的任意氨基酸,R/KXXR/K結(jié)構(gòu)需位于肽鏈碳端。Tat序列中存在RKKR元件,但其位于肽鏈的氮端而非碳端,逆序后的Tat即transTat嚴(yán)格符合CendR。因此,本課題以transTat作為研究對(duì)象,考察其穿膜性與抑制新生血管生成的活性。為使transTat具有更好的靶向作用,將RGD與transTat連接,考察RGD-transTat抑制新生血管生成活性,為治療新生血管疾病的肽鏈提供多一種選擇。本文的主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:(1)TransTat和Tat穿膜性的對(duì)比研究本研究中首先對(duì)比研究了 transTat和Tat穿膜活性。通過細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)與熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)合發(fā)現(xiàn)transTat的穿膜能力與Tat相當(dāng),將Tat序列逆轉(zhuǎn)后得到的transTat對(duì)tat的穿膜能力沒有影響。(2)TransTat、RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、成管實(shí)驗(yàn)以及雞胚尿囊膜模型評(píng)價(jià)了 Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD 5種多肽抑制新生血管的生成活性。結(jié)果表明,Tat與transTat對(duì)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞增殖與成管沒有顯著性影響,對(duì)HUVEC的遷移有一定的抑制作用,但二者之間沒有顯著性差異,可以表明逆序后的Tat,即transTat,沒有顯示出更強(qiáng)的抑制新生血管生成的活性。RGD-transTat對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移以及成管的抑制作用明顯增強(qiáng),且RGD位于肽鏈碳端與氮端對(duì)transTat活性沒有顯著影響。(3)Tat、transTat、RGD、RGDtransTat 和 transTatRGD 與 NRP1、整合素αvβ3的結(jié)合能力利用HUVEC細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)以及通過共聚焦顯微鏡觀察Tat、transTat、RGD、RGDtransTat 和 transTatRGD 5 種多肽在 HUVEC 細(xì)胞上與 NRP-1、整合素αvβ3的共定位,結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),除RGD外,Tat、transTat、RGDtransTat和transTatRGD 4種多肽對(duì)NRP1均具有一定的結(jié)合能力,transTatRGD稍弱一些。Tat與transTat對(duì)αvβ 3的特異性結(jié)合與RGDtransTat、transTatRGD相比較弱。本論文的創(chuàng)新點(diǎn)包括:(1)將Tat逆序后得到一種新的穿膜肽transTat,并對(duì)其抑制新生血管生成的活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。(2)將 RGD 與 transTat 連接合成 RGDtransTat 和 transTatRGD,研究了它們抑制新生血管生成的活性以及初步的作用機(jī)制,并評(píng)價(jià)了 RGD位于碳端與氮端對(duì)transTat活性的影響。
【圖文】：

逡逑圖２－３邋ｔｒａｎｓＴａｔ對(duì)Ｔａｔ的穿膜能力的影響（見實(shí)驗(yàn)記錄本０００５３５８－ｐ６８－ｐ７0）逡逑（藍(lán)色表示細(xì)胞核位置、綠色表示藥物位置）逡逑Ｆｉｇ．Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓＴａｔ邋ｏｎ邋Ｔａｔ＊ｓ邋ａｂｉｌｉｔｙ邋ｔｏ邋ｐｅｎｅｔｒａｔｅ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｔｈｅ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑（Ｂｌｕｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｎｕｃｌｅｕｓ邋ａｎｄ邋ｇｒｅｅｎ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｄｒｕｇ）逡逑３．３邋ＨＵＶＥＣ邋對(duì)邋ＴｒａｎｓＴａｔ、Ｔａｔ邋的攝取率逡逑通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ＨＵＶＥＣ對(duì)ＴｒａｎｓＴａｔ、Ｔａｔ的攝取率，結(jié)果如圖２－４所示。逡逑結(jié)果顯示，０．５邋ｈ時(shí)，ＨＵＶＥＣ對(duì)二者的攝取率已經(jīng)達(dá)到９７％左右，ｔｒａｎｓＴａｔ的攝逡逑取率略高一些，二者具有顯著性差異；ｌｈ時(shí)，二者的攝取率均達(dá)到９９％以上，逡逑沒有顯著性差異。結(jié)果表明，ｔｒａｎｓＴａｔ可能穿透細(xì)胞膜的速度更快，，但是總體來逡逑說兩者的穿膜能力沒有差別。逡逑邐Ｔ說邐邋ｔｒａｉ＾Ｊａｔ邐逡逑０．５邋ｈ邐§逡逑Ｓ：邐．逡逑１＾－邐灥邐ｖ邐煖逡逑°邐■邐°邋ｓ－逡逑８」逡逑－—ｍｉｉ＞｜邋ｉ邋ｍｍ邋－邋ｉ邐ｉ邋ｉ邋ｍｉ邋ｉ邋ｍｍ逡逑？０＊邋Ｉ０４邋ＪＯ＇邋Ｉｌｆ邋１邋｝0？邋ｔｏ＊邋＞０＊邋）0？邋＞ｌｆ邋ｔｏ７逡逑ＦＩＴＣ－Ａ邐ｒｉＴＣ－Ａ逡逑ｆｌ邐１１邐ＰＩ逡逑１邋Ｈ邋ｇ邋１逡逑；邐ｆｌ：逡逑ｎ邐ｆｔ邐Ｈ：邐Ｂ逡逑３邋；邐

本文編號(hào)：2624218