【摘要】：現(xiàn)階段,社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,外源性有害物質(zhì)急需進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估依靠大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在周期長(zhǎng)、成本高以及倫理道德等問題,毒理學(xué)替代研究逐漸受到重視。研究人員經(jīng)過不斷實(shí)驗(yàn)改進(jìn),采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等技術(shù)代替動(dòng)物毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn),逐步形成了替代毒理學(xué)這一具有鮮明特色的學(xué)科,但是在替代毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,遺傳毒性檢測(cè)的有效替代模型還處于起步發(fā)展階段,許多細(xì)節(jié)尚不清楚。CD59突變檢測(cè)體系能夠有效評(píng)估環(huán)境因素中誘變劑引發(fā)的遺傳毒性,因此我們利用瓊脂糖低黏附培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建該體系的三維細(xì)胞模型,評(píng)價(jià)該體系在形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)方面的信息,對(duì)比三維體系與傳統(tǒng)單層細(xì)胞的環(huán)境毒理響應(yīng)差異。主要研究結(jié)果如下:1.形態(tài)學(xué)觀察。通過對(duì)不同條件下細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)二維細(xì)胞呈現(xiàn)出單層貼壁生長(zhǎng)形態(tài),細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)出近似于球狀生長(zhǎng)形態(tài),培養(yǎng)期間細(xì)胞團(tuán)形態(tài)不均一,篩選后分析各類細(xì)胞團(tuán)特征發(fā)現(xiàn)致密細(xì)胞團(tuán)特性較為穩(wěn)定,因此我們最終選擇瓊脂糖低黏附懸浮培養(yǎng)法建立三維體系模型。深入觀察致密細(xì)胞團(tuán)發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞團(tuán)逐漸增多,形態(tài)會(huì)更加均勻,連續(xù)培養(yǎng)8天后,細(xì)胞團(tuán)直徑達(dá)240 μm,單細(xì)胞團(tuán)內(nèi)約有1725個(gè)細(xì)胞。研究結(jié)果說明細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間連接的重新排列,從而使得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,最終影響到細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。2.自發(fā)突變率及生化指標(biāo)檢測(cè)。為鑒定該細(xì)胞團(tuán)是優(yōu)良的三維培養(yǎng)體系,我們通過克隆形成法和CD59基因突變檢測(cè)分析三維培養(yǎng)體系中細(xì)胞活性和本底突變情況,研究發(fā)現(xiàn)三維體系在連續(xù)培養(yǎng)期間保持良好的細(xì)胞增殖能力,突變本底沒有顯著變化。另一方面,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法分析了細(xì)胞特異性基因表達(dá)產(chǎn)物,研究發(fā)現(xiàn)三維體系中細(xì)胞干性相關(guān)基因(Oct4、Nanog、Sox2、Lin28等)以及細(xì)胞連接基因(Connexin 43和LI-Cadherin)有明顯上調(diào)現(xiàn)象,其中培養(yǎng)8天的三維體系中Oct4基因表達(dá)倍數(shù)為5.90 ± 0.53,Cx43基因表達(dá)倍數(shù)為3.20 ± 0.20,研究結(jié)果均表明三維體系表現(xiàn)出比二維細(xì)胞更好的增殖能力和細(xì)胞連接能力。3.環(huán)境物質(zhì)毒性評(píng)估。構(gòu)建穩(wěn)定三維培養(yǎng)模型后,我們首先評(píng)價(jià)環(huán)境污染物毒性效應(yīng),包括重金屬、持久性有毒污染物以及納米材料,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三維體系存活率更高、突變率更低,表現(xiàn)出明顯的抵抗作用,元素?cái)z取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三維體系多層結(jié)構(gòu)能抵擋外源性污染物進(jìn)入內(nèi)部細(xì)胞,同時(shí)鑒于射線能夠穿透細(xì)胞層,我們進(jìn)一步研究輻射損傷效應(yīng),結(jié)果表明修復(fù)蛋白高表達(dá)以及細(xì)胞周期停滯等原因,三維體系具有明顯的輻射抵抗效應(yīng)。研究結(jié)果表明三維培養(yǎng)體系由于多層結(jié)構(gòu)與動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)一致,生化特性與體內(nèi)細(xì)胞相類似,因此能夠提供更為準(zhǔn)確的體內(nèi)細(xì)胞信息。綜上所述,我們采用瓊脂糖低黏附懸浮培養(yǎng)法構(gòu)建三維遺傳毒性檢測(cè)體系,通過動(dòng)態(tài)觀察、穩(wěn)定性評(píng)估、毒性檢測(cè)等結(jié)果說明三維培養(yǎng)體系作為遺傳毒性檢測(cè)的有效替代模型,能夠?yàn)槎纠韺W(xué)研究提供更接近于體內(nèi)細(xì)胞的信息。
【圖文】：

叐怎Ｉ逡逑ＭＢW逡逑圖１．３邋３Ｄ上皮卵巢癌（ＥＯＣ）細(xì)胞恢復(fù)組織分化特征丨４８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ邋ｏｆ邋ＥＯＣ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅｓ邋ｒｅｓｔｏｒｅｓ邋ｆｅａｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ逡逑綜上所述，，在毒性學(xué)研宄方面，３Ｄ培養(yǎng)技術(shù)比傳統(tǒng)毒理學(xué)研宄模型有著明逡逑顯的優(yōu)勢(shì)，具體如下：逡逑（１）

ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ邋ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ逡逑胚胎干細(xì)胞類器官逡逑圖１．４細(xì)胞組織培養(yǎng)發(fā)展史\″義希疲椋紓酰潁邋澹保矗澹齲椋螅簦錚潁澹錚駑澹悖澹歟歟酰歟幔蟈澹簦椋螅螅酰邋澹悖酰歟簦酰潁邋義希保卞義

本文編號(hào)：2623770