【摘要】：現(xiàn)階段,社會經(jīng)濟的高速發(fā)展,外源性有害物質(zhì)急需進行風險評估,毒性風險評估依靠大量的動物實驗,而動物實驗存在周期長、成本高以及倫理道德等問題,毒理學替代研究逐漸受到重視。研究人員經(jīng)過不斷實驗改進,采用體外細胞實驗等技術(shù)代替動物毒性檢測實驗,逐步形成了替代毒理學這一具有鮮明特色的學科,但是在替代毒性檢測實驗中,遺傳毒性檢測的有效替代模型還處于起步發(fā)展階段,許多細節(jié)尚不清楚。CD59突變檢測體系能夠有效評估環(huán)境因素中誘變劑引發(fā)的遺傳毒性,因此我們利用瓊脂糖低黏附培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建該體系的三維細胞模型,評價該體系在形態(tài)學、生化指標方面的信息,對比三維體系與傳統(tǒng)單層細胞的環(huán)境毒理響應(yīng)差異。主要研究結(jié)果如下:1.形態(tài)學觀察。通過對不同條件下細胞形態(tài)的動態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)二維細胞呈現(xiàn)出單層貼壁生長形態(tài),細胞團呈現(xiàn)出近似于球狀生長形態(tài),培養(yǎng)期間細胞團形態(tài)不均一,篩選后分析各類細胞團特征發(fā)現(xiàn)致密細胞團特性較為穩(wěn)定,因此我們最終選擇瓊脂糖低黏附懸浮培養(yǎng)法建立三維體系模型。深入觀察致密細胞團發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時間的增加,細胞團逐漸增多,形態(tài)會更加均勻,連續(xù)培養(yǎng)8天后,細胞團直徑達240 μm,單細胞團內(nèi)約有1725個細胞。研究結(jié)果說明細胞生長微環(huán)境的改變會導致細胞間連接的重新排列,從而使得細胞形態(tài)發(fā)生變化,最終影響到細胞的結(jié)構(gòu)和功能。2.自發(fā)突變率及生化指標檢測。為鑒定該細胞團是優(yōu)良的三維培養(yǎng)體系,我們通過克隆形成法和CD59基因突變檢測分析三維培養(yǎng)體系中細胞活性和本底突變情況,研究發(fā)現(xiàn)三維體系在連續(xù)培養(yǎng)期間保持良好的細胞增殖能力,突變本底沒有顯著變化。另一方面,通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法分析了細胞特異性基因表達產(chǎn)物,研究發(fā)現(xiàn)三維體系中細胞干性相關(guān)基因(Oct4、Nanog、Sox2、Lin28等)以及細胞連接基因(Connexin 43和LI-Cadherin)有明顯上調(diào)現(xiàn)象,其中培養(yǎng)8天的三維體系中Oct4基因表達倍數(shù)為5.90 ± 0.53,Cx43基因表達倍數(shù)為3.20 ± 0.20,研究結(jié)果均表明三維體系表現(xiàn)出比二維細胞更好的增殖能力和細胞連接能力。3.環(huán)境物質(zhì)毒性評估。構(gòu)建穩(wěn)定三維培養(yǎng)模型后,我們首先評價環(huán)境污染物毒性效應(yīng),包括重金屬、持久性有毒污染物以及納米材料,實驗結(jié)果表明三維體系存活率更高、突變率更低,表現(xiàn)出明顯的抵抗作用,元素攝取實驗發(fā)現(xiàn)三維體系多層結(jié)構(gòu)能抵擋外源性污染物進入內(nèi)部細胞,同時鑒于射線能夠穿透細胞層,我們進一步研究輻射損傷效應(yīng),結(jié)果表明修復蛋白高表達以及細胞周期停滯等原因,三維體系具有明顯的輻射抵抗效應(yīng)。研究結(jié)果表明三維培養(yǎng)體系由于多層結(jié)構(gòu)與動物組織結(jié)構(gòu)一致,生化特性與體內(nèi)細胞相類似,因此能夠提供更為準確的體內(nèi)細胞信息。綜上所述,我們采用瓊脂糖低黏附懸浮培養(yǎng)法構(gòu)建三維遺傳毒性檢測體系,通過動態(tài)觀察、穩(wěn)定性評估、毒性檢測等結(jié)果說明三維培養(yǎng)體系作為遺傳毒性檢測的有效替代模型,能夠為毒理學研究提供更接近于體內(nèi)細胞的信息。
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叐怎Ｉ逡逑ＭＢW逡逑圖１．３邋３Ｄ上皮卵巢癌（ＥＯＣ）細胞恢復組織分化特征丨４８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ邋ｏｆ邋ＥＯＣ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅｓ邋ｒｅｓｔｏｒｅｓ邋ｆｅａｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ逡逑綜上所述，，在毒性學研宄方面，３Ｄ培養(yǎng)技術(shù)比傳統(tǒng)毒理學研宄模型有著明逡逑顯的優(yōu)勢，具體如下：逡逑（１）

ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ邋ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ逡逑胚胎干細胞類器官逡逑圖１．４細胞組織培養(yǎng)發(fā)展史\″義希疲椋紓酰潁邋澹保矗澹齲椋螅簦錚潁澹錚駑澹悖澹歟歟酰歟幔蟈澹簦椋螅螅酰邋澹悖酰歟簦酰潁邋義希保卞義

本文編號：2623770