【摘要】：肺癌在男性和女性癌癥患者中均居首位,嚴重威脅著人類的健康。目前,對于肺癌的治療主要采用手術(shù)和化學(xué)治療為主,但治療效果并不理想,其中,有相當比例的患者產(chǎn)生耐藥。尋找新的藥物作用靶點對于降低肺癌死亡率有重要意義。他汀類藥物是羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,在臨床上廣泛用于高脂血癥的預(yù)防和治療。近年,流行病學(xué)研究資料表明長期使用他汀類藥物可以有效降低結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌等癌癥發(fā)病率。但其對肺癌的作用尚不清楚,本課題中,我們研究了阿托伐他汀對人肺癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響并進一步探究了其相關(guān)作用機制。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的主要原因。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制,它是由復(fù)雜的多基因調(diào)控完成的。EMT的發(fā)生參與了細胞的遷移過程。TGF-β1是發(fā)生EMT的關(guān)鍵因子。本實驗中,我們通過劃痕實驗和Transwell體外侵襲實驗觀察阿托伐他汀對HCC827細胞遷移能力的變化,并建立以TGF-β1誘導(dǎo)的HCC827細胞體外EMT模型,進一步檢測阿托伐他汀對TGF-β1誘導(dǎo)的HCC827細胞遷移的影響,同時檢測了阿托伐他汀對EMT過程中的標志性蛋白E-cadherin、N-cadherin以及遷移相關(guān)蛋白MMP2表達的作用。第一部分阿托伐他汀對人肺癌HCC827細胞增殖和凋亡的作用目的:研究阿托伐他汀(atorvastatin,ATO)對人肺癌細胞株HCC827增殖和凋亡的影響并探究其作用機制。方法:臺盼藍染色計數(shù)法檢測阿托伐他汀對人肺癌HCC827和A549細胞增殖的抑制作用;流式細胞術(shù)檢測HCC827細胞周期的變化;光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化;Hoechst 33342和TUNEL法檢測細胞凋亡;DCFH-DA(2,7-dichlorofluorescenin diacetate)熒光探針檢測活性氧(ROS)水平;比色法檢測丙二醛(MDA)含量變化;Western blot法檢測P-H2A.X、Cleaved-caspase 3、Bax和Bcl-2蛋白表達。結(jié)果:1.阿托伐他汀藥物濃度在0-40μM時,隨著給藥濃度的增加,對人肺癌HCC827細胞和A549細胞增殖的抑制作用越明顯,細胞的存活率不斷降低,且阿托伐他汀對HCC827細胞的抑制作用明顯強于A549細胞,抑制作用呈劑量和時間依賴性。2.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,不同濃度阿托伐他汀(2.5μM、10μM、40μM)作用后,與對照組相比,阿托伐他汀組處于G1期細胞的數(shù)量明顯增多,處于S期和G2期細胞比例都降低。3.光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài),對照組細胞生長狀態(tài)良好,阿托伐他汀組細胞皺縮、體積變小、脫落、漂浮于培養(yǎng)液中的死細胞明顯增多。4.Hoechst 33342染色結(jié)果顯示,阿托伐他汀作用后,改變了HCC827細胞核的形態(tài),細胞核呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、呈新月狀等凋亡特征。5.TUNEL熒光染色結(jié)果顯示,阿托伐他汀組細胞核內(nèi)綠色熒光強度明顯高于對照組,提示阿托伐他汀誘導(dǎo)HCC827細胞DNA斷裂。6.DCFH-DA熒光探針檢測HCC827細胞活性氧(ROS)水平結(jié)果顯示,與對照組相比,阿托伐他汀組細胞綠色熒光顯著增強,說明胞內(nèi)ROS水平顯著增加。7.比色法檢測丙二醛(MDA)含量結(jié)果顯示,阿托伐他汀組HCC827細胞內(nèi)MDA含量隨著阿托伐他汀藥物濃度的增加不斷提高。8.阿托伐他汀可上調(diào)HCC827細胞中P-H2A.X、Cleaved-caspase 3和Bax蛋白表達,下調(diào)Bcl-2蛋白表達,Bax/Bcl-2比值上調(diào)。小結(jié):阿托伐他汀能明顯抑制HCC827和A549細胞的生長,且對HCC827細胞生長抑制作用更明顯,生長抑制作用可能與其引起細胞周期阻滯有關(guān);阿托伐他汀可誘導(dǎo)HCC827細胞產(chǎn)生凋亡,這可能與氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)因子的調(diào)控參與了阿托伐他汀誘導(dǎo)HCC827細胞的凋亡有關(guān)。第二部分阿托伐他汀對人肺癌HCC827細胞遷移的作用目的:研究阿托伐他汀對人肺癌HCC827細胞遷移的影響并探究其作用機制。方法:采用劃痕實驗和Transwell體外侵襲實驗檢測阿托伐他汀對HCC827細胞遷移的影響;Western blot法檢測細胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin和MMP2蛋白的表達。結(jié)果:1.細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,阿托伐他汀能夠明顯抑制HCC827細胞的遷移,TGF-β1能夠明顯促進HCC827細胞的遷移,阿托伐他汀還能夠明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HCC827細胞的遷移。2.Transwell體外遷移實驗結(jié)果顯示,阿托伐他汀可明顯降低HCC827細胞的穿膜細胞數(shù),TGF-β1明顯增加了HCC827細胞的穿膜細胞數(shù),與TGF-β1組相比,阿托伐他汀聯(lián)合TGF-β1組穿膜細胞數(shù)明顯降低。3.阿托伐他汀降低了HCC827細胞N-cadherin和MMP-2蛋白的表達,對E-cadherin蛋白的表達無影響;TGF-β1能夠明顯增加HCC827細胞N-cadherin、MMP-2蛋白的表達,對E-cadherin蛋白的表達無影響;阿托伐他汀能夠明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的HCC827細胞N-cadherin和MMP-2蛋白的高表達,對E-cadherin蛋白的表達無影響。小結(jié):阿托伐他汀能夠抑制HCC827細胞的遷移,也能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HCC827細胞的遷移,可能與阿托伐他汀干擾HCC827細胞EMT過程以及下調(diào)MMP2蛋白表達有關(guān)。結(jié)論:1.阿托伐他汀能夠抑制HCC827細胞的增殖,該增殖抑制作用可能與阿托伐他汀干擾HCC827細胞周期有關(guān);阿托伐他汀可誘導(dǎo)HCC827細胞產(chǎn)生凋亡,這可能與氧化應(yīng)激介導(dǎo)途徑和凋亡相關(guān)因子的調(diào)控參與了阿托伐他汀誘導(dǎo)HCC827細胞的凋亡。2.TGF-β1可以誘導(dǎo)HCC827細胞EMT的發(fā)生,阿托伐他汀能夠抑制HCC827細胞的遷移,也能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HCC827細胞的遷移,可能與阿托伐他汀干擾了HCC827細胞EMT過程以及下調(diào)MMP2蛋白表達有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 阿托伐他汀對 HCC827 和 A549 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of atorvastatin on proliferation of HCC827 and A549 cells. (A)Survival rate of HCC827 cells after 24 h, 48 h and 72 h treatment withatorvastatin at different concentration gradients (2.5 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM,40 μM). (B) Survival rate of A549 cells after 24 h, 48 h and 72 h treatmentwith atorvastatin at different concentration gradients (2.5 μM, 5 μM, 10 μM,20 μM, 40 μM). The experimental results are expressed as mean ± standarderror (n = 3,*P < 0.05 compared to the control group, **P < 0.01 compared tothe control group).2. 阿托伐他汀對HCC827 細胞周期的影響經(jīng)流式細胞術(shù)檢測阿托伐他汀對HCC827 細胞周期的結(jié)果顯示，空白對照組與不同濃度梯度的阿托伐他�。�2.5 μM、10 μM、40 μM）作用于HCC827 細胞 48 h后處于G1 期的細胞數(shù)所占的比例分別為 47.3 ± 9.9 %，

圖 2 阿托伐他汀對 HCC827 細胞周期的影響ffect of atorvastatin on HCC827 cell cycle. Atorvastatin withration gradients(0 μM, 2.5 μM, 10 μM, 40 μM) induced G17 cell cycle after 48 h treatment. The experimental reed as mean ± standard error (n = 3, *P < 0.05 compared to th*P < 0.01 compared to the control group).阿托伐他汀對HCC827 細胞形態(tài)的影響顯微鏡下可以明顯地看出，對照組細胞生長狀態(tài)良好、貼中未見大量漂浮細胞。不同濃度梯度的阿托伐他�。�2.5 μM）作用于HCC827 細胞 48 h后，可見給藥組細胞隨著濃明顯地形態(tài)變化：細胞皺縮、體積變小、脫落死亡，培養(yǎng)液亡細胞。（Fig.3）。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Poynter J. N.;Gruber S. B.;Higgins P. D. R.;寧寧;;他汀類藥物與結(jié)腸直腸癌風(fēng)險[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(心臟病學(xué)分冊);2005年10期

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本文編號：2623464