【摘要】：錳是公認的急、慢性蓄積性神經(jīng)毒素,錳中毒可產(chǎn)生類似于帕金森樣中樞神經(jīng)損傷的癥狀且脫毒后癥狀持續(xù)存在,原因在于錳在大腦聚積誘發(fā)特定區(qū)域的神經(jīng)細胞死亡和功能喪失,進而使中樞神經(jīng)發(fā)生退行性變。錳中毒誘發(fā)的神經(jīng)細胞死亡方式包括凋亡、自噬及壞死三種形式,目前錳中毒的神經(jīng)元死亡機制研究主要集中于神經(jīng)元凋亡。近年的研究表明,細胞的壞死也具有細胞內(nèi)特定的信號轉導系統(tǒng),與受體相互作用蛋白3(Receptor interacting protein 3,RIP3)密切相關,RIP3被認為是調(diào)節(jié)依賴于RIP1介導的細胞凋亡與壞死間發(fā)生轉換的關鍵因子。這一RIP3和混合系列激酶樣結構域蛋白((Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)的順序激活誘導的可調(diào)控性細胞死亡稱為程序性壞死(Necroptosis)。我們前期的實驗證實錳中毒可誘發(fā)神經(jīng)元的壞死,壞死細胞的超微結構表現(xiàn)為趨向于凋亡細胞的形態(tài)特征,提示錳中毒誘導的神經(jīng)元壞死可能具有程序性壞死的調(diào)節(jié)機制,而錳誘導的細胞壞死是否與Necroptosis有關,目前尚無報道。本研究擬通過體內(nèi)、外實驗,運用細胞凋亡Caspase抑制劑zVAD-fmk和程序性壞死信號通路的特異性阻滯劑necrostatin-1(Nec-1)、RNA干擾等研究策略,探討RIP3介導的程序性壞死信號通路在錳致神經(jīng)元死亡中的作用。方法(一)zVAD-fmk、Nec-1對染錳SK-N-SH細胞的影響(1)以400 uM MnCL_2.2H_2O建立SK-N-SH細胞染錳模型,然后應用不同濃度zVAD-fmk、Nec-1進行干預。取對數(shù)生長期SK-N-SH細胞進行干預,分為Control group、400μmol/L Mn、0.5μmol/L zVAD-fmk、2μmol/L zVAD-fmk、60μmol/L Nec-1、120μmol/L Nec-1、Mn+0.5μmol/L zVAD-fmk、Mn+2μmol/L z VAD-fmk、Mn+60μmol/L Nec-1、Mn+120μmol/L Nec-1共10組,通過觀察細胞形態(tài)、MTT法及流式細胞術觀察染錳與藥物干預對SK-N-SH細胞存活、凋亡及壞死的影響;(2)取對數(shù)生長期細胞分成5組,分別為Control group、200μmol/L Mn、400μmol/L Mn、400μmol/L Mn+0.5μmol/L zVAD-fmk、400μmol/L Mn+120μmol/L Nec-1,通過Western blot檢測RIP3的蛋白表達量變化、DCFH-DA探針檢測各組細胞ROS的生成情況。(二)慢病毒介導RIP3 RNAi對染錳SK-N-SH細胞的影響(1)構建慢病毒介導的RIP3 RNAi SK-N-SH細胞株;(2)降低(Knock down,KD)SK-N-SH細胞的RIP3基因表達后,進行染錳實驗,并進行Nec-1干預。具體分組為:空白SK-N-SH細胞組(Control group),SK-N-SH細胞染400μmol/L Mn組,RIP3 Scrambled細胞組(NC),RIP3 RNAi細胞組,RIP3 RNAi細胞+Mn組,RIP3 RNAi細胞+Mn+120μmol/L Nec-1組。通過MTT法、流式細胞術檢測RIP3表達降低后染錳及Nec-1干預對SK-N-SH細胞存活、凋亡及壞死的影響;Western blot檢測各組RIP3和磷酸化MLKL的蛋白表達變化。(三)Nec-1對亞急性錳暴露大鼠黑質和海馬的影響(1)Sprague Dawley(SD)大鼠60只分為對照組、Nec-1對照組、錳中毒組和Nec-1干預錳中毒組。所有動物均先通過手術作側腦室埋管,然后通過腹腔注射錳溶液建立亞急性錳中毒模型(15 mg/kg,5天/w,共4w),同時對藥物干預組給予側腦室內(nèi)注射Nec-1(19.28 mmol/L,5μL/次,3次/w,共4w),染錳及干預結束后拔除側腦室置管,連續(xù)飼養(yǎng)動物兩周;(2)大鼠經(jīng)灌注固定后,免疫組織化學法觀察黑質酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)陽性細胞和海馬CA1區(qū)膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)陽性細胞表達的變化,透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元細胞的超微結構變化;(3)大鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死動物,取黑質組織,PCR熒光定量法檢測RIP3、Bcl-2、Caspase3、NOX2和NOX4基因的表達。結果(一)程序性壞死抑制劑Nec-1可減少染錳SK-N-SH細胞的死亡(1)與對照組相比較,人SK-N-SH細胞染錳24h后,細胞胞體皺縮變圓、突起回縮變短、胞漿內(nèi)可見大量泡l錘謀，

本文編號：2621892