發(fā)布時間：2020-04-09 03:38

【摘要】：一研究背景他克莫司(tacrolimus,FK506)是一種鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitors,CNIs),1989年首次應(yīng)用于臨床。FK506的結(jié)構(gòu)雖然與環(huán)孢素A(Cyclosporin A,CsA)大不相同,但其作用的機(jī)制基本相似,主要是通過特異性抑制鈣調(diào)磷酸酶活性,從而阻滯T細(xì)胞激活過程,同時還有CsA所不具備的T-細(xì)胞依賴性抗體的生成,阻滯細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,呈現(xiàn)雙重的免疫抑制作用。其藥效強(qiáng)度是CsA的10～100倍,它能有效地預(yù)防心臟移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生,并具有較少的不良反應(yīng),但其藥動學(xué)個體差異較大、治療窗狹窄,而且易受其他合并用藥的影響。因此,為了確保合適的暴露量,臨床實(shí)施治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring,TDM)是十分必要的。目前FK506的檢測方法主要有免疫法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)。雖然免疫法已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的規(guī)范操作,操作簡單、方便、自動化程度高,然而,其靈敏度低、專屬性弱,常因FK506代謝物的交叉反應(yīng),導(dǎo)致測定的濃度往往高于實(shí)際濃度。相反,HPLC-MS/MS只檢測FK506母藥的濃度,專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高,能校正免疫法的差異。人體對藥物反應(yīng)的個體差異源于與藥物藥代動力學(xué)和藥效學(xué)相關(guān)的各種功能蛋白的分子變異。有關(guān)分子變異的研究,主要集中在基因變異對于上述蛋白的表達(dá)和功能的影響。目前國內(nèi)外有關(guān)FK506個體化用藥研究主要集中在藥物代謝酶(CYIP3A4和CYIP3A5)及轉(zhuǎn)運(yùn)體(P-gp)的遺傳多態(tài)性上,但是有關(guān)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)因子、藥效學(xué)途徑中靶蛋白的遺傳多態(tài)性與FK506血藥濃度的研究較少,仍無定論。二研究內(nèi)容及方法本研究包括2部分內(nèi)容,首先開發(fā)建立了測定人全血中FK506濃度的HPLC-MS/MS分析方法,并與臨床TDM采用的CMIA方法比較,評價兩種方法監(jiān)測FK506濃度的相關(guān)性,以及兩種方法在治療藥物監(jiān)測中的應(yīng)用,探討在中國心臟移植患者中基因多態(tài)性對術(shù)后FK506血藥濃度的影響,為實(shí)現(xiàn)FK506的個體化用藥提供理論依據(jù)。第一部分HPLC-MS/MS和CMIA法檢測心臟移植患者全血他克莫司濃度的比較研究研究目的比較CMIA法與HPLC-MS/MS法監(jiān)測FK506濃度的相關(guān)性,以及兩種方法在治療藥物監(jiān)測中的應(yīng)用。研究方法1.研究對象:心臟移植患者術(shù)后接受FK506治療藥物監(jiān)測的全血樣本(n=581)。2.建立HPLC-MS/MS法測定全血中FK506的血藥濃度,并與CMIA測定的結(jié)果進(jìn)行比較,用Bland-Altman法進(jìn)行一致性分析,計算95%參考區(qū)間(即一致限LoA)作為參考區(qū)域,若有至少95%的散點(diǎn)位于該一致限內(nèi),可認(rèn)為兩種方法的一致性較好。3.用SPSS version 19.0軟件進(jìn)行配對t檢驗(yàn)和Pearson線性回歸分析兩種方法的測定結(jié)果,P0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1.開發(fā)建立HPLC-MS/MS測定人全血FK506濃度,線性范圍2-30 ng/ml,定量下限為2 ng/ml;日內(nèi)及日間精密度(RSD%)均小于15%。2.按照 Bland-Altman 法計算,95.52%LoA=(0.2,5.6),95.52%的差值都位于一致限內(nèi),兩種方法測定值一致性良好。回歸方程為yHPLC-MS/MS=0.7011xCMIA-0.1668(R2=0.9024),說明兩種方法具有良好的相關(guān)性,CMIA方法的測定值較HPLC-MS/MS方法的測定值高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。第二部分 在中國心臟移植患者中基因多態(tài)性對他克莫司體內(nèi)藥物濃度的影響研究目的探討在中國心臟移植患者中基因多態(tài)性對FK506體內(nèi)藥物濃度的影響。研究方法1.研究對象:2009-2017年阜外醫(yī)院心臟移植術(shù)后服用FK506的200例患者作為實(shí)驗(yàn)組,100例健康人作為對照組。2.心臟移植患者初次給予FK506,服藥第2天晨起空腹抽取靜脈血2 ml(EDTA抗凝),采用 CMIA 法檢測 FK506 的全血濃度(blood trough concentration,C0)。3.基因多態(tài)性檢測:采用PCR-直接測序法、PCR、HMassArray(?)SNP方法對相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。1)PCR-直接測序法:CYP3A5*3(rs776746 AG),NR1I2(rs2276707 C＞T),IL-10(rs1800872 C＞A),TGF-β1(rs1800470 C＞T),TGF-β1(rs1800471 G＞C)2)PCR:ACE rs1799752 ID3)MassArray(?)SNP:CYP3A5(rs28365085,T＞C,rs10264272 GA,rs4130334327131_27132insA),CYP3A4(rs35599367 CT,rs2740574 CT,rs28371759 AG,rs2242480CT,rs33972239 delA,rs4646437 AG,rs138105638 GA),CYP2C8*3(rs11572080 CT),ABCB1(rs1128503 CT,rs2032582 GT/A,rs1045642 CT,rs2229109 CT),SLCO1B1(rs2306283 GA),NR1I2(rs6785049 GA,rs3814055 CT),PPAR-α(rs4253728 GA,rs4823613 AG),POR(rs1057868 CT,rs2868177 AG),COMT(rs165599 GA,rs2239393 AG,rs4646312 TC,rs4680 GA,rs6267 GT,rs737865 AG),IL-2(rs2069762 TG,rs2069763 CA),IL-3(rs181781 GA),IL-4(rs2070874 IC),IL-6(rs1800796 GC,rs1800795 GC),IL-10(rs1800871 GA,rs1800896 AG),IL-18(rs1946518 1G),TNF-α-308(rs1800629 GA),TLR-4(rs1927907 GA),CTLA4(rs4553808 AG),PPP3CA(rs3804358 GC),PPP3CB(rs3763679 TC),PPP3R1(rs1868402 GA),CALM1(rs12885713 CT)4.使用 SPSS(version 19.0,SPSS Inc,Chicago,USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理;計量資料結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不同基因組間FK506 C0的比較采用非參數(shù)統(tǒng)計方法;多組之間的比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn),兩組之間的比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn);最終用多元線性回歸方法校正可能與FK506血藥濃度有關(guān)的因素(年齡、性別、肝功能、腎功能),分析基因多態(tài)性與FK506血藥濃度的關(guān)系。研究結(jié)果1.除 COMT rs165599,COMT rs6267 和 PPP3R1 rs1868402(P0.01)外,其它 SNPs均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。患者組 TGF-β1 rs1800470 C、CYP3A5*3 rs776746G 等位基因頻率高于對照組(P=0.03);IL-6 rs1800796C、CYP3A4*1G rs2242480 C等位基因的頻率低于對照組(P = 0.03)。2.心臟移植患者初始劑量給藥后,對FK506C0有統(tǒng)計學(xué)差異的基因位點(diǎn):1)純合野生型高于雜合/純和突變型:CYP3A4*1G、CYP3A4rs339722392)純合野生型低于雜合/純和突變型:IL-2 rs2069762 TG 3)純合野生型/雜合低于純和突變型:CYP3A5*3、CYP3A4rs4646437AG、4)純和野生型低于純和突變型:PPP3R1 rs1868402 GA 3.校正年齡、性別等因素后,多元線性回歸結(jié)果顯示,有2個基因多態(tài)性位點(diǎn)綜合起來可解釋23.1%的FK506血藥濃度變異,而這23.1%中,CYP3A5*3解釋了 38.7%,IL-2 rs2069762 TG 解釋了 15.6%。年齡、性別及 CYP3A4*1G、CYP3A4 rs33972239 delA、CYP3A4 rs4646437AG、PPP3R1 rs1868402 GA 均對 FK506 C0的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.消除 CYP3A5*3 因素的影響后,CYP3A4a*1G、CYP3A4 rs33972239 delA、CYP3A4 rs4646437 AG、PPP3R1 rs1868402 GA 及 IL-2 rs2069762 TG對FK506C0的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。三研究結(jié)論1.LC-MS/MS方法定量檢測全血中FK506的濃度,具有很好的專屬性,不會與FK506體內(nèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生交叉反應(yīng),使得測量值更準(zhǔn)確可信。2.CMIA法和LC-MS/MS法在檢測FK506血藥濃度時具有良好的一致性和相關(guān)性,均可用于常規(guī)TDM。3.在中國心臟移植患者中,FK506 C0與CYP3A5*3、IL-2 rs2069762 TG之間存在相關(guān)性。4.通過基因分型,結(jié)合TDM常規(guī),能客觀地預(yù)測不同患者移植術(shù)后使用FK506的初始劑量,提高免疫治療效果,降低毒性反應(yīng)。
【圖文】：

５．統(tǒng)計分析逡逑（１）用Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ法進(jìn)行一致性分析。計算原始數(shù)據(jù)每一個配對的均值與差逡逑值，繪制Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ散點(diǎn)圖。同時計算９５％參考區(qū)間（即一致限ＬｏＡ）作逡逑為參考區(qū)域，若有至少９５％的散點(diǎn)位于該一致限內(nèi)，可認(rèn)為兩種方法的一逡逑致性較好。逡逑（２）用ＳＰＳＳ邋ｖｅｒｓｉｏｎ邋１９．０軟件進(jìn)行配對ｔ檢驗(yàn)和Ｐｅａｒｓｏｎ線性回歸分析兩種方法逡逑的測定結(jié)果，Ｐ＜０．０５表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑研究結(jié)果逡逑１．邋ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法學(xué)考察與評價逡逑１．１專屬性逡逑在本實(shí)驗(yàn)條件下，ＦＫ５０６和內(nèi)標(biāo)ＦＫ－５０６－１３Ｃ，Ｄ２（Ｍａｊｏｒ）的保留時間分別為逡逑１．７５ｍｉｎ、１．７４ｍｉｎ，空白全血中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾ＦＫ５０６及內(nèi)標(biāo)的測定，見圖１。逡逑Ａ逡逑

３．邋ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法與ＣＭＩＡ法結(jié)果比較逡逑按照Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ法計算，９５．５２％的差值都位于一致限ＬｏＡ邋（０．２，５．６）內(nèi)，逡逑可認(rèn)為兩種方法的一致性較好，見圖２。逡逑１０邋－逡逑？邐Ｏ逡逑0逡逑８邋－邋0邋0逡逑0邋０逡逑６邐邐邐邋l捨海卞邐瘛╁邋五五五義希ⅲ村澹，

本文編號：2620239