發(fā)布時間：2020-04-09 08:09

【摘要】：背景:關于內(nèi)生真菌(Fungi endophytes)的研究最早始于1989年,由Vogl從植物黑麥草的種子中分離出來。后經(jīng)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的多種生物學活性,我國幅員遼闊、地大物博、氣候適宜等良好外在條件更造就了豐富多樣的內(nèi)生真菌資源,關于藥用植物內(nèi)生真菌資源的研究有待被不斷開發(fā)。目的:通過對藥用植物日本鳶尾(Iris japonica)進行分離培養(yǎng)來初步探索其是否具有內(nèi)生真菌資源,同時對純化后的內(nèi)生真菌菌株進行鑒定,以及內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗菌活性分析,以此來不斷發(fā)現(xiàn)和豐富我國藥用植物內(nèi)生真菌資源。方法:首先對藥用植物日本鳶尾進行表面消毒,組織剪切分離后開始恒溫培養(yǎng),對培養(yǎng)出的內(nèi)生真菌菌株進一步分離純化;肉眼以及染色顯微鏡檢方法觀察菌落形態(tài)、菌絲、孢子結(jié)構(gòu)等性狀,對不產(chǎn)生孢子菌株通過更換培養(yǎng)基、低溫處理、紫外燈照射、間歇光照方法誘導產(chǎn)生孢子,從傳統(tǒng)形態(tài)學方面對內(nèi)生真菌進行初步鑒定;對菌落形態(tài)典型菌株采用PCR擴增內(nèi)生真菌的ITS序列,將測序得到的ITS序列結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中,通過BLAST比對選出與該序列相關性較高的核酸序列,利用軟件MEGA-10.0采用鄰接法(Neighbor-joining NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,對相關內(nèi)生真菌種屬類別予以進一步分類鑒定;最后采用酶標儀快速檢測法與瓊脂平板打孔法對鑒定出的內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液進行抗菌活性分析。結(jié)果:從藥用植物日本鳶尾的根、莖、葉組織塊中共分離出68株內(nèi)生真菌,定殖率分別為74.07%、79.16%、86.95%,分離率分別為85.18%、66.66%、42.02%,經(jīng)純化鑒定為5種,分別為橘青霉(Penicillium citrinum)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、肉色隔孢伏革菌(Peniophora incarnata)、小新殼梭孢菌(Neofusicoccum parvum)、葉點霉屬的Phyllosticta capitalensis(有性型為球座菌屬(Guignardia)),日本鳶尾內(nèi)生真菌對宿主具有一定的組織專一性,其中根中以橘青霉和尖孢鐮刀菌為主,莖中以小新殼梭孢菌為主,葉中以橘青霉和肉色隔孢伏革菌以及葉點霉屬的Phyllosticta capitalensis為主;在4種誘導方法中低溫處理對孢子產(chǎn)生效果最佳;未發(fā)現(xiàn)五株典型內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白假絲酵母菌有明顯抑菌活性。結(jié)論:從藥用植物日本鳶尾中成功分離鑒定出5種內(nèi)生真菌,為藥用植物內(nèi)生真菌的開發(fā)和利用提供了一定基礎。
【圖文】：

日本鳶尾內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗菌活性研究2. 材料與方法.1 實驗材料.1.1 實驗植物藥用植物：日本鳶尾植株于 2017 年 5 月采自于湖南師范大學醫(yī)學院院內(nèi)中園，主要采集成熟老葉、無病害腐爛的新鮮健康植株，并保證其根莖葉等器組織齊全無破損，4℃冰盒保存?zhèn)溆�，同時在 48h 以內(nèi)盡快進行處理。

屬的Phyllosticta capitalensis，分別命名為R1-R5。3.4.1日本鳶尾內(nèi)生真菌菌株R1的鑒定圖3-1為菌株R1在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周的菌落形態(tài)和顯微鏡下圖，觀察和記錄內(nèi)生真菌在平板上的生長形態(tài)特征。圖3-1 菌株R1注：a.菌落形態(tài) b.分生孢子梗和分生孢子（100×）形態(tài)觀察顯示：菌落顏色呈典型深綠色，質(zhì)地呈絨狀或絮狀，，產(chǎn)生明顯的黃色滲滴液，顯微鏡下染色觀察可見有大量分生孢子產(chǎn)生，分布相對密集，分生孢子球形或近球形。菌絲體呈白色或淺黃色，分布稀少，對照《真菌鑒定手冊》和《真菌的形態(tài)和分類》將菌株R1初步鑒定為子囊菌門、不整囊菌綱、曲霉目、發(fā)菌科、青霉屬（Penicillium）。根據(jù)內(nèi)生真菌的形態(tài)鑒定結(jié)果，同時查閱同屬的真菌鑒定相關文獻，最終以植物內(nèi)生真菌通用引物ITS1和ITS4，對提取的內(nèi)生真菌DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后進行測序
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239;R915

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本文編號：2620514