【摘要】：背景:關(guān)于內(nèi)生真菌(Fungi endophytes)的研究最早始于1989年,由Vogl從植物黑麥草的種子中分離出來(lái)。后經(jīng)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的多種生物學(xué)活性,我國(guó)幅員遼闊、地大物博、氣候適宜等良好外在條件更造就了豐富多樣的內(nèi)生真菌資源,關(guān)于藥用植物內(nèi)生真菌資源的研究有待被不斷開(kāi)發(fā)。目的:通過(guò)對(duì)藥用植物日本鳶尾(Iris japonica)進(jìn)行分離培養(yǎng)來(lái)初步探索其是否具有內(nèi)生真菌資源,同時(shí)對(duì)純化后的內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行鑒定,以及內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的抗菌活性分析,以此來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)和豐富我國(guó)藥用植物內(nèi)生真菌資源。方法:首先對(duì)藥用植物日本鳶尾進(jìn)行表面消毒,組織剪切分離后開(kāi)始恒溫培養(yǎng),對(duì)培養(yǎng)出的內(nèi)生真菌菌株進(jìn)一步分離純化;肉眼以及染色顯微鏡檢方法觀(guān)察菌落形態(tài)、菌絲、孢子結(jié)構(gòu)等性狀,對(duì)不產(chǎn)生孢子菌株通過(guò)更換培養(yǎng)基、低溫處理、紫外燈照射、間歇光照方法誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子,從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方面對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行初步鑒定;對(duì)菌落形態(tài)典型菌株采用PCR擴(kuò)增內(nèi)生真菌的ITS序列,將測(cè)序得到的ITS序列結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中,通過(guò)BLAST比對(duì)選出與該序列相關(guān)性較高的核酸序列,利用軟件MEGA-10.0采用鄰接法(Neighbor-joining NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),對(duì)相關(guān)內(nèi)生真菌種屬類(lèi)別予以進(jìn)一步分類(lèi)鑒定;最后采用酶標(biāo)儀快速檢測(cè)法與瓊脂平板打孔法對(duì)鑒定出的內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液進(jìn)行抗菌活性分析。結(jié)果:從藥用植物日本鳶尾的根、莖、葉組織塊中共分離出68株內(nèi)生真菌,定殖率分別為74.07%、79.16%、86.95%,分離率分別為85.18%、66.66%、42.02%,經(jīng)純化鑒定為5種,分別為橘青霉(Penicillium citrinum)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、肉色隔孢伏革菌(Peniophora incarnata)、小新殼梭孢菌(Neofusicoccum parvum)、葉點(diǎn)霉屬的Phyllosticta capitalensis(有性型為球座菌屬(Guignardia)),日本鳶尾內(nèi)生真菌對(duì)宿主具有一定的組織專(zhuān)一性,其中根中以橘青霉和尖孢鐮刀菌為主,莖中以小新殼梭孢菌為主,葉中以橘青霉和肉色隔孢伏革菌以及葉點(diǎn)霉屬的Phyllosticta capitalensis為主;在4種誘導(dǎo)方法中低溫處理對(duì)孢子產(chǎn)生效果最佳;未發(fā)現(xiàn)五株典型內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白假絲酵母菌有明顯抑菌活性。結(jié)論:從藥用植物日本鳶尾中成功分離鑒定出5種內(nèi)生真菌,為藥用植物內(nèi)生真菌的開(kāi)發(fā)和利用提供了一定基礎(chǔ)。
【圖文】：

日本鳶尾內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗菌活性研究2. 材料與方法.1 實(shí)驗(yàn)材料.1.1 實(shí)驗(yàn)植物藥用植物：日本鳶尾植株于 2017 年 5 月采自于湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院院內(nèi)中園，主要采集成熟老葉、無(wú)病害腐爛的新鮮健康植株，并保證其根莖葉等器組織齊全無(wú)破損，4℃冰盒保存?zhèn)溆�，同時(shí)在 48h 以?xún)?nèi)盡快進(jìn)行處理。

屬的Phyllosticta capitalensis，分別命名為R1-R5。3.4.1日本鳶尾內(nèi)生真菌菌株R1的鑒定圖3-1為菌株R1在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周的菌落形態(tài)和顯微鏡下圖，觀(guān)察和記錄內(nèi)生真菌在平板上的生長(zhǎng)形態(tài)特征。圖3-1 菌株R1注：a.菌落形態(tài) b.分生孢子梗和分生孢子（100×）形態(tài)觀(guān)察顯示：菌落顏色呈典型深綠色，質(zhì)地呈絨狀或絮狀，，產(chǎn)生明顯的黃色滲滴液，顯微鏡下染色觀(guān)察可見(jiàn)有大量分生孢子產(chǎn)生，分布相對(duì)密集，分生孢子球形或近球形。菌絲體呈白色或淺黃色，分布稀少，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》和《真菌的形態(tài)和分類(lèi)》將菌株R1初步鑒定為子囊菌門(mén)、不整囊菌綱、曲霉目、發(fā)菌科、青霉屬（Penicillium）。根據(jù)內(nèi)生真菌的形態(tài)鑒定結(jié)果，同時(shí)查閱同屬的真菌鑒定相關(guān)文獻(xiàn)，最終以植物內(nèi)生真菌通用引物ITS1和ITS4，對(duì)提取的內(nèi)生真菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S567.239;R915

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本文編號(hào)：2620514