【摘要】：低分子量蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP)是一種結(jié)構(gòu)不典型的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs),在PTPs家族中被單獨(dú)分成一類,進(jìn)化上高度保守,廣泛表達(dá)于多種生物中,包括植物、原核生物和古細(xì)菌等。天然產(chǎn)物在自然界中含量豐富,是重要的藥物寶庫,在藥物開發(fā)領(lǐng)域得到了廣泛的研究。秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans,C.elegans)是一種優(yōu)秀的模式生物,具有繁殖能力強(qiáng)、生命周期短、蟲體小易操作、通體透明便于觀察、可在液氮中長期凍存、細(xì)胞譜系已完全確定等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),線蟲有許多在進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路,與人類基因同源性達(dá)60%~80%。線蟲lmwptp基因與人類acp1基因同源,經(jīng)計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬得知兩者蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似,因此推測(cè)兩者生物學(xué)功能及作用機(jī)制具有相似之處。應(yīng)激反應(yīng)是生物體對(duì)抗外界刺激所發(fā)生反應(yīng)的總稱,隨著自然環(huán)境的惡化及生活節(jié)奏的加快,人們受到體內(nèi)外刺激的種類和頻率逐漸增多,這些刺激會(huì)破壞機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡,影響生物體的日常行為和健康,導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,因此生物抗應(yīng)激的預(yù)防及治療日益受到重視。本文應(yīng)用線蟲模型研究了LMW-PTP在應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制,并對(duì)抗應(yīng)激天然產(chǎn)物進(jìn)行了篩選。首先,本文成功構(gòu)建了用于線蟲lmwptp RNAi的pPD129.36-lmwptp質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達(dá),通過免疫家兔成功制備出線蟲LMW-PTP多克隆抗體,通過qPCR和Western Blot兩種方法證明了lmwptp RNAi的有效性。其次,本文檢測(cè)了lmwptp RNAi對(duì)線蟲一般生理指標(biāo)的影響,發(fā)現(xiàn)lmwptp RNAi不影響線蟲的壽命、產(chǎn)卵數(shù)、吞咽頻率、體長,但lmwptp RNAi后第7天的線蟲出現(xiàn)了一種特殊運(yùn)動(dòng)狀態(tài),線蟲除了在培養(yǎng)基平面上做正弦曲線運(yùn)動(dòng)外,還在垂直方向“抬頭”和/或“翹尾”;lmwptp RNAi后線蟲體內(nèi)脂肪含量明顯增多,這一現(xiàn)象的產(chǎn)生與lmwptp RNAi后降低一些脂肪分解基因如acdh-1、acs-2的表達(dá)量和升高一些脂肪合成基因如fat-6、mdt-15、pod-2、elo-5的表達(dá)量有關(guān);并且lmwptp RNAi明顯提高了線蟲的應(yīng)激抵抗性,包括熱應(yīng)激、紫外輻射應(yīng)激和氧化應(yīng)激抵抗性。然后,本文進(jìn)一步探究了LMW-PTP在熱應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)lmwptp RNAi可降低線蟲體內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen specie,ROS)水平,提高線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,減少線蟲體內(nèi)脂褐素累積量,LMW-PTP負(fù)調(diào)控線蟲應(yīng)激抵抗性的作用與類胰島素信號(hào)通路有關(guān),LMW-PTP可能作用于DAF-2,進(jìn)而改變類胰島素信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子DAF-16和HSF-1的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位及兩者下游靶基因的表達(dá)量。接下來,本文應(yīng)用線蟲模型對(duì)50種天然產(chǎn)物的抗紫外輻射功能進(jìn)行了篩選,由于薄荷水提物抗紫外輻射的作用效果穩(wěn)定,因此本文進(jìn)一步探究了薄荷水提物提高線蟲紫外輻射抵抗性的原因,發(fā)現(xiàn)薄荷水提物可以降低紫外輻射后線蟲體內(nèi)ROS含量和提高SOD活性,并且這種作用與類胰島素信號(hào)通路有關(guān),薄荷水提物可以促進(jìn)DAF-16細(xì)胞核轉(zhuǎn)位并增加其下游靶基因sod-3、hsp-12.6、hsp-16.1、hsp-16.49的表達(dá)量。最后,本文探究了薄荷中的水溶性成分香蜂草苷在線蟲抵抗紫外輻射應(yīng)激過程中的作用和機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了0.1 mM香蜂草苷可以延長線蟲壽命,提高線蟲抵抗紫外輻射應(yīng)激、35°C熱應(yīng)激、胡桃醌氧化應(yīng)激的能力,并且可以降低紫外輻射后線蟲體內(nèi)ROS水平并且提高SOD活性,其提高線蟲紫外輻射應(yīng)激抵抗性的作用與類胰島素信號(hào)通路有關(guān),香蜂草苷可能作用于該通路上游的DAF-2來發(fā)揮作用,進(jìn)而促進(jìn)DAF-16的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,增加下游基因sod-3和hsp-16.2的表達(dá)量。綜上所述,本文應(yīng)用線蟲模型研究了低分子量蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的生物學(xué)功能,著重研究了其在應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制,并對(duì)50種天然產(chǎn)物水提物的抗紫外輻射功能進(jìn)行了篩選,著重研究了薄荷水提物及其水溶性成分香蜂草苷提高線蟲紫外輻射抵抗性的作用機(jī)制。本文不僅發(fā)現(xiàn)了PTPs家族的新功能,還為抗應(yīng)激藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了理論依據(jù),具有一定的市場(chǎng)前景和社會(huì)意義。
【圖文】：

圖 1. 1 LMW-PTP 氨基酸序列比對(duì)圖（引自參考文獻(xiàn)[24]）Figure 1. 1 LMW-PTP amino acid sequence alignment map

3圖 1. 2 LMW-PTP 催化機(jī)理示意圖（引自參考文獻(xiàn)[24]）Figure 1. 2 LMW-PTP catalytic mechanism diagram
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R965.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 王月明;姜艷艷;劉斌;;薄荷水提物HPLC特征圖譜研究[J];北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2010年11期

2 吳可克,王舫,劉建峰,王曉華,單新強(qiáng);烏發(fā)組方要素對(duì)酪氨酸酶活性的影響研究[J];日用化學(xué)工業(yè);2001年03期

3 方慧;呂圭源;陳素紅;蘇潔;牟秀華;黃敏聰;;三味辛涼歸肺經(jīng)中藥對(duì)肺陰虛模型小鼠的影響[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2011年05期

4 孫婧,王建新;白發(fā)成因及其防治研究進(jìn)展[J];香料香精化妝品;2003年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 周琳;應(yīng)用線蟲模型研究低分子量蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶在應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制及抗應(yīng)激天然產(chǎn)物的篩選[D];吉林大學(xué);2019年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 孫婧;天然中草藥中烏發(fā)成分的提取和性能測(cè)定[D];江南大學(xué);2005年

，

本文編號(hào)：2620221